Genom człowieka

Budowa chromosomów

Genom człowieka to nić DNA o długości w przybliżeniu 3 mld pz zawarta w jednym haploidalnym zestawie 23 chromosom6w. Liczba diploidalna chromosomów człowieka w każdej prawidłowej, somatycznej komórce wynosi 46.

Nić DNA zorganizowana jest na kilku poziomach upakowania począwszy od chromatyny aż do chromosomu metafazowego, który wykazuje 10 000 większą kondensację DNA niż chromatyna jądra interfazowego. W chromosomach DNA jest połączony z białkami, które pośredniczą w procesach transkrypcji, replikacji lub są białkami strukturalnymi. Kompleks DNA-białko nazywany jest chromatyną. Wśród białek tego kompleksu największą masę stanowią histony oraz białka niehistonowe. W porównaniu z innymi białkami histony zawierają zwiększoną liczbę aminokwasów zasadowych /lizyna, arginina/, co ułatwia im wiązanie się z DNA. Pięć histonów H1, H2A, H2B, H3 i H4 to elementy nukleosornu podstawowej jednostki upakowania chromatyny. Struktura nukleosomowa włókna chromatynowego o szerokości 30 μm buduje chromatynę w jądrze interfazowym. Chromatyna ta wykazuje zróżnicowany stopień kondensacji. Silnie skondensowana to heterochromatyna, zaś mniej skondensowana to euchromatyna.

W dalszym etapie organizacji chromatyny włókno 30 μm ulega pofałdowaniu i skróceniu przyjmując postać solenoidu. Pęt1e solenoidu zawierają 2 000-100 000 pz i powstają dzięki białkom niehistonowym wiążącym się w miejscach specyficznych włókna chromatynowego.

Kolejne poziomy organizacji wyższego rzędu prowadzą do uwidocznienia chromosomów jako indywidualnych struktur podczas podziału komórkowego. Chromosom metafazowy przyjmuje najbardziej skondensowaną postać chromatyny w wyniku tworzenia kolejnych skrętów i pęt1i solenoidu, dzięki wzajemnym oddziaływaniom pomiędzy białkami tworzącymi siateczkę lub rusztowanie chromosomu. Dużą rolę odgrywa w tych procesach niehistonowe białko jądrowe topoizomeraza II. Chromosomy metafazowe zbudowane są z dwóch identycznych siostrzanych chromatyd. Szerokość pojedynczej chromatydy wynosi około 700 μm.

Miejsce połączenia chromatyd to centromer /tzw. przewężenie pierwotne/, który dzieli chromosom na dwa ramiona: krótkie „p” i długie „q”. Regiony na obu końcach ramion określane są telomerami W zależności od polożenia centromeru chromosomy różnicowane są na chromosomy meta-, submeta- lub akrocentryczne. W przypadku chromosomów metacentrycznych długość obu ramion jest w przybliżeniu taka sama, w odróżnieniu od chromosomów submetacentrycznych, w których ramię p jest wyraźnie krótsze od ramienia q. Chromosomy akrocentryczne wyróżniają się obecnością na krótkich ramionach grudek chromatyny zwanych satelitami. W krótkich ramionach akrocentryków par 13-15 i 21-22 występują tzw. przewężenia wtórne w obrębie których zlokalizowane są organizatory jąderkowe NORs /ang. nucleolus organizer regions/. Miejsca te zawierają powtarzające się geny kodujące rRNA: 5,8 S, 18 S, i 28 S. Podczas interfazy NORs ulegają dekondensacji i tworzą jąderko.

W morfologii chromosomu niezbędnym elementem struktury jest centromer, będący miejscem przyłączenia włókien wrzeciona podziałowego, co zapewnia właściwą segregację chromosomów w czasie mitozy i mejozy. W skład centromeru wchodzi kilka milionów pz. Są to w większości sekwencje powtórzone /satelitarny DNA/ ale występują także sekwencje rozproszone /typu SINES czy LINES/. We wszystkich centromerach stwierdzono powtarzające się bloki tzw. sekwencji alfa o długości 171 nukleotydów i powtarzającym się motywie 5-nukleotydowym /GGAAT/. Pozostałe sekwencje satelitarnego DNA są charakterystyczne dla określonych chromosomów. W skład centromeru wchodzą również białka.

Telomery uniemożliwiają zlepianie się chromosomów i zapewniają określoną lokalizację wewnątrz jądra. Zbudowane są z powtarzającej się sekwencji /TTAGGG/. W momencie urodzenia człowieka długość poszczególnych telomerów wynosi 6 000-10 000 nukleotydów. Z wiekiem ulegają zmniejszeniu podczas kolejnych podziałów komórek somatycznych. Zjawisko skracania się telomerów jest wyznacznikiem procesu starzenia się, może prowadzić do śmierci komórki. Długość telomerów w komórkach rozrodczych i zarodkowych utrzymywana jest przez enzym telomerazę, który jest białkiem połączonym z RNA komplernentarnym do powtarzających się sekwencji w telomerach. RNA służy jako matryca do wydłużania telomerów. Telomeraza jest nieobecna w komórkach somatycznych, ale często pojawia się w komórkach nowotworowych.

W obrębie chromosomów wyróżnia się miejsca zawierające euchromatynę czyli kodujące regiony transkrypcyjnie aktywne. W przeciwieństwie do aktywnej euchromatyny, heterochromatyna jest pozbawiona genów lub obejmuje nieaktywne geny. Heterochromatynowe odcinki pozostają bardziej skondensowane w interfazie niż euchromatynowe i replikują w bardzo późnej fazie S cyklu komórkowego. W mikroskopie elektronowym heterochromatyna widoczna jest w postaci włókien o dużej gęstości elektronowej. Po odpowiednim wybarwieniu można ją też zobaczyć w mikroskopie świetlnym. Część heterochromatyny pozostaje heterochromatyczna we wszystkich stadiach rozwoju komórki i obejmuje obszar dookoła centromerów, w długim ramieniu chromosomu Y i w satelitach chromosomów akrocentrycznych. Jest to heterochromatvna konstytutywna, która może być uwidoczniona mikroskopowo barwieniem chromosomów na obecność prążków C. Niektóre fragmenty chromatyny mogą pozostać w formie zarówno heterochromatynowej jak i euchromatynowej. Fragmenty te zwane są heterochromatyną fakultatywną. Dobrym przykładem na to jest u człowieka zjawisko lyonizacji. Polega ono na tym, że jeden z dwóch chromosomów X u kobiet jest blokowany we wczesnym. etapie rozwoju zarodkowego w celu wyrównania podwójnej dawki genów chromosomów X w porównaniu z pojedynczą kopią tych genów u mężczyzn.. Nieaktywny chromosom X pozostaje w znacznym stopniu skondensowany i podczas interfazy barwi się na kolor ciemny tworząc tzw. ciałko Barra w jądrach komórek nabłonka jamy ustnej.

Otrzymywanie chromosomów człowieka.

Ana1izę i klasyfikację chromosomów dokonuje się na podstawie badania cytogenetycznego, które polega na określeniu liczby i struktury chromosomów w komórkach badanej osoby. Analiza taka może być przeprowadzona na chromosomach metafazowych lub prometafazowych otrzymanych z hodowli in vitro dzielących się komórek somatycznych lub w niektórych przypadkach bezpośrednio z tkanek o wysokiej aktywności mitotycznej /np. z komórek guzów nowotworowych i z komórek szpiku kostnego/.

Postępowanie laboratoryjne w celu określenia kariotypu przebiega według następującego schematu:

1. Namnażanie komórek z pobranego materiału w hodowli in vitro na podłożu hodowlanym przy użyciu stymulatora wzrostu jakim jest najczęściej fitohemaglutynina.

2 Nagromadzenie komórek w stadium metafazy drogą wprowadzenia do hodowli na określony czas /1-2 godz./ kolchicyny, która zatrzymuje podziały komórkowe w stadium metafazy, podczas której morfologia chromosomów jest najlepiej widoczna.

3. Zakończenie hodow1i i przygotowanie preparatów. Komórki poddawane są szokowi hipotonicznemu /roztwór 0,075 M chlorku sodu/ celem uzyskania rozproszenia chromosomów. Następnie komórki są utrwalane w mieszaninie lodowatego kwasu octowego i metanolu. Utrwalona zawiesina komórek zostaje nakropiona na szkiełku podstawowym.

4. Barwienie chromosomów technikami prążkowymi.

5; Analiza chromosomów przy użyciu mikroskopu świetlnego /pow. 1000x/ oraz wykonanie dokumentacji fotograficznej do sporządzenia kariogramu.. Obecnie na szeroką skalę stosuje się sprzężone z mikroskopem analizatory obrazu z oprogramowaniem pozwalającym na szybką, półautomatyczną lub automatyczną ocenę wybarwionych chromosomów.

Najbardziej dogodną metodą uzyskiwania chromosomów są krótkotrwałe /46-96 godz./ hodowle limfocytów krwi obwodowej. Do oznaczania kariotypu mogą również służyć fibroblasty skóry, które uzyskuje się najczęściej przez pobranie niewielkiego wycinka skóry. Komórki te rosną in vitro przyrośnięte do dna naczynia hodowlanego ale wymagają długiego czasu do otrzymania odpowiednio dużej liczby dzielących się komórek przydatnych do badań cytogenetycznych. Dlatego, hodowle fibroblastów stosuje się jedynie w określonych, uzasadnionych diagnostycznie przypadkach, najczęściej wtedy, gdy obraz kariotypu na podstawie limfocytów nie odpowiada obrazowi klinicznemu pacjenta.

Prenatalnej oceny kariotypu dokonuje się na podstawie badania chromosomów płynu owodniowego lub komórek trofoblastu. Komórki płynu owodniowego /amniocyty/ uzyskiwane są przez amniopunkcję między 15 -18 tyg. ciąży. Czas trwania badania wynosi najczęściej 10-21 dni. Komórki trofoblastu otrzymuje się drogą aspiracji przez powłoki brzuszne lub rzadziej przez szyjkę macicy między 10-14 tyg. ciąży.

Materiałem do badań cytogenetycznych mogą być także komórki nowotworowe szpiku kostnego pochodzące bezpośrednio z biopsji oraz fragmenty tkanki litych guzów nowotworowych.

Metody analizy chromosomów

Opracowanie w latach 70-tych technik prążkowych barwienia chromosomów umożliwiło dokładną identyfikację każdej z 23 par chromosomów człowieka. Tym samym stało się możliwe rozpoznanie aberracji /nieprawidłowości/ chromosomowych. Techniki prążkowe prowadzą do uzyskania specyficznego układu prążków na chromosomach. Każdy chromosom ma charakterystyczny dla siebie wzór prążkowy czyli układ poprzecznych prążków różniących się wielkością i intensywnością zabarwienia.

Podstawowe techniki barwienia chromosomów w celu uzyskania prążków są następujące:

Technika GTG /wzór prążkowy G uzyskany przez trawienie chromosomów trypsyną i

barwienie barwnikiem Giemsy/. W mikroskopie swietlnym obserwuje się na przemian ciemne i jasne prążki. Wzór prążków umożliwia identyfikacje poszczególnych chromosomów w badanej płytce metafazowej, wykrycie aberracji liczby i niektórych rodzajów aberracji strukturalnych.

Standardowe badania prowadzone są na chromosomach metafazowych o stosunkowo małej liczbie prążków /350 do 550/ w haploidalnym zestawie chromosomów. W pojedynczym prążku zawarte jest średnio 4-10 mln pz, co wyznacza granice identyfikacji wielkości materiału genetycznego, który uległ zmianie. Chromosomy z wcześniejszych stadiów podziału komórkowego, prometafazowe lub profazowe wykazują mniejszą kondensację a w efekcie od 500 do1250 prążków w haploidalnym zestawie chromosomów Metoda uzyskiwania chromosomów o zwiększonej rozdzielczości obrazu prążkowego określana jest jako HRT /ang. high resolution technique/. W pojedynczym prążku przy uzyciu HRT zawarte jest 2-3 mln pz. Metoda ta pozwala więc na większą precyzję w określaniu nieprawidłowości materiału genetycznego.

Technika QFQ /wzór prążkowy Q uzyskany poprzez wybarwienie chromosomów barwnikiem fluorescencyjnym - pochodne akrydyny/. W mikroskopie fluorescencyjnym widoczne są na przemian jasne i ciemne prążki fluorescencyjne. Jasne prążki Q odpowiadają ciemno wybarwionym prążkom G. Wzór prążków G , poza nielicznymi wyjątkami, odpowiada obrazowi prążków Q.

Technika RHG /wzór prążkowy R uzyskany po podgrzaniu w roztworze buforowym i wybarwieniu chromosomów barwnikiem Giemsy/ Wzór prążków R stanowi odwrotność prążków G. Regiony mocno zabarwione w prążkach G są jasne w prążkach R i odwrotnie.

Technika CBG /technika wybarwienia heterochromatyny konstytutywnej przez ogrzewanie chromosomów wodorotlenkiem baru i barwienie barwnikiem Giemsy/. Prążki C są obszarami heterochromatyny konstytutywnej zlokalizowanej przy centromerach wszystkich chromosomów oraz w długim ramieniu chromosomu Y.

Technika Ag-NOR /wysrebrzania regionów jąderkotwórczych przy użyciu azotanu srebra/. Metoda ta uwidacznia w postaci złogów srebra aktywne transkrypcyjnie regiony NORs zlokalizowane w chromosomach akrocentrycznych par 13-15 i 21-22.

Z wielu doświadczeń wiadomo, że przy użyciu wyżej wymienionych klasycznych metod cytogenetycznych stwierdza się wprawdzie obecność aberracji chromosomowych, ale rozpoznanie cytogenetyczne jest mało precyzyjne i niewystarczające dla właściwej diagnozy. W takich przypadkach są wskazania do zastosowania bardziej precyzyjnych metod cytogenetyki molekularnej.

Opracowane w latach 80-tych metody cytogenetyki molekularnej oparte są na osiągnięciach biologii molekularnej i cytogenetyki klasycznej. Główną zaletą tych metod jest możliwość lokalizacji DNA lub RNA bezpośrednio w materiale biologicznym /bez izolowania DNA/ w preparatach chromosomowych, komórkach interfazowych, w skrawkach utrwalonych tkanek, w rozmazach komórkowych - na wszystkich etapach kondensacji chromosomu.

Podstawową metodą cytogenetyki molekularnej jest technika FISH /ang. fluorescence in situ hybridization/. W badaniu tą metodą sonda molekularna, którą jest specyficzny fragment DNA, wiąże się z komplementarnym do niej DNA chromosomowym na preparacie. Metoda FISH jest etapowa i wymaga przygotowania sondy /wyznakowanie barwnikiem flurescencyjnym, denaturacja sondy/ i preparatu /denaturacja DNA chromosomowego/. Po nałożeniu sondy na preparat następuje powolna hybrydyzacja wykrywane jest w mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiednie filtry świetlne Fluorochrom znakujący sondę pod wpływem promieniowania UV emituje światło widzialne, które po przejściu przez filtry daje obraz jasno świecącego regionu obserwowanego w mikroskopie fluorescencyjnym.

Inną metodą badania chromosomów jest analiza cytometryczna w cytometrze przepływowym, która polega na ocenie zawartości DNA lub stosunku par zasad AT/GC w poszczególnych chromosomach. Oceny takiej dokonuje się na podstawie pomiarów intensywności fluorescencji chromosomów metafazowych zabarwionych fluorochromem. Technika ta umożliwia sortowanie i identyfikację poszczeg6lnych chromosomów. Stosowana jest jako metoda uzupełniająca konwencjonalną analizę prążkową, do wykrywania aberracji liczbowych i strukturalnych.

Zasady analizy kariotypu

Podstawowe zasady klasyfikacji i identyfikacji chromosomów człowieka zostały opracowane na 3 konferencjach w Denver /1960/, w Londynie /1963/ i w Paryżu /1971/. Zestaw chromosomów przedstawiany jest parami /jeden chromosom z każdej pary pochodzi od matki drugi od ojca/ i nazywa się kariogramem. Zestaw chromosomów został podzielony na 7 łatwych do odróżnienia grup. W każdej grupie pary chromosomów mają podobny kształt i wielkość oraz uszeregowane są według malejącej wielkości:

1 grupa (A) obejmuje największe chromosomy meta- i submetacentryczne pary 1, 2, 3

2 grupa (B) obejmuje duże chromosomy submetacentryczne pary 4 i 5

3 grupa (C) obejmuje średnie chromosomy meta- i submetacentryczne pary 6, 7, 8, 9, 10,11 i 12

4 grupa (D) obejmuje średnie chromosomy akrocentryczne pary 13, 14 i 15

5 grupa (E) obejmuje mniejsze chromosomy meta- i submetacentryczne pary 16, 17 i 18

6 grupa (F) obejmuje małe chromosomy metacentryczne pary 19 i 20

7 grupa (G) obejmuje małe chromosomy akrocentryczne pary 21 i 22

Pary chromosomów od 1 -22 to tzw. autosomy, ostatnią parę stanowią chromosomy płci: XX u kobiety i XY u mężczyzny. Chromosom X jest submetacentryczny i odpowiada wielkością grupie 3 a chromosom Y jest małym akrocentrykiem i odpowiada grupie 7.

Przyjęty międzynarodowy system nazewnictwa cytogenetycznego oraz ujednolicony opis obrazu prążkowego chromosomów umoż1iwiają jednoznaczne określenie kariotypu. Opis kariotypu uwzględnia zawsze liczbę chromosomów, chromosomy płci oraz określenie stwierdzonej aberracji chromosomowej. Prawidłowy kariotyp żeński to 46,XX, prawidłowy kariotyp męski to 46,XY . Zapis liczbowej aberracji polega na umieszczeniu znaku /+/ gdy występuje dodatkowy chromosom lub znaku /-/ gdy brak chromosomu. W przypadku aberracji strukturalnych opis zawiera określone symbole stosowane .w nazewnictwie cytogenetycznym. Niżej przedstawiono wybrane przykłady tych symboli:

del - delecja

der - pochodny

dic - chromosom dicentryczny

fra - miejsce łamliwe

i - izochromosom

inv - inwersja

mar - chromosom markerowy

mat - pochodzenie matczyne

p - krótkie ramię

pat - pochodzenie ojcowskie

q - długie ramie

r - chromosom pierścieniowy

t - translokacja

ter - terminalny koniec chromosomu

pter - terminalny koniec ramienia p

qter - terminalny koniec ramienia q.

Numeracja prążków umożliwia precyzyjne określenie miejsc złamania chromosomu. Ramię krótkie /p/ i ramię długie /q/ chromosomu podzielone jest na regiony ponumerowane kolejno od centromeru ku górze i do dołu /ryc.3/. Prążki w obrębie danego regionu są również ponumerowane kolejno z zachowaniem. tego samego kierunku numeracji. Oznaczenie podaje zawsze jako pierwszy numer regionu a następnie numer prążka w obrębie tego regionu. Prążki dzielą się na podprążki widoczne jedynie w długich chromosomach po zastosowaniu technik dużej rozdzielczości prążkowej. Numeracja podprążków podana jest po numeracji prążków i oddzielona od. niej kropką.

Np. 1q32.1 oznacza chromosom 1, długie ramię, region 3, prążek 2 , podprążek 1.

Przykłady zapisu aberracji chromosomowych

47,XY,+21 trisomia chromosomu 21 /zespół Downa/

47,XXY trisomia chromosomów płci /zespół Klinefeltera/

45,X monosomia chromosomu X /zespół Turnera/

46,XY,t (8;12)(pl1;q15) translokacja wzajemna, zrównoważona pomiędzy chromosomem 8 i12. Punkty złamań chromosomów podane w drugim nawiasie.

46,XX,del (5)(p25) delecja terminalna krótkiego ramienia chromosomu 5 od prążka p25

Polimorfizm chromosomów

Polimorfizm chromosomów to występowanie różnic w ich budowie u różnych osób w populacji, które są dziedziczne i nie powodują zmian fenotypowych. Dla ich uwidocznienia wymagane jest stosowanie niekiedy specjalnych technik cytogenetycznych. Do najczęściej występujących polimorfizmów chromosomowych należą:

1. zmienność wielkości długiego ramienia chromosomu Y

2. zmienność wielkości heterochromatyny przycentromerowej (szczególnie dobrze widoczna w chromosomach pary 1, 9, 16 i Y)

3. zmienność wielkości i struktury satelitów w chromosomach akrocentrycznych pary 13, 14, 15, 21 i 22

Analiza polimorfizmu może być przydatna w rozróżnianiu chromosomów pochodzenia matczynego lub ojcowskiego.

1

---