Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych,
polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną, które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze,
w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich temperatur,
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych cd.
proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,
odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,
badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych cd.
Tm - jest to tzw. odwracalny punkt topnienia - temperatura przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i tworzącymi się w wyniku renaturacji,
ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi,
Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na+, liczby par G-C, długość hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych cd.
Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:
DNA - DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,
DNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,
RNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z komplementarna cząsteczką RNA.
Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest zróżnicowana:
RNA -RNA > DNA -RNA > DNA -DNA
Sondy molekularne
W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane chemicznie (zwykle o długości 10 - 50 nukleotydów).
Zalety sond syntetycznych:
- stosunkowo łatwa dostępność,
- możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,
- nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,
- krótki czas hybrydyzacji,
- wysoka selektywność.
Znakowanie sond molekularnych
Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu 32P w miejsce niepromieniotwórczych atomów fosforu.
Można tego dokonać poprzez:
- przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty fosfonowej [γ 32P] ze znakowanego ATP na koniec 5' cząsteczki sondy
lub
- wbudowując w łańcuch sondy [γ 32P] - deoksyfosfonukleozydy w procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).
W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.
Znakowanie sond molekularnych
Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w
znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny
lub digoksygeniny.Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w
procesach dwustopniowych:
Etap I:
- użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy digoksygeninie,
streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).
Etap II:
- w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.
Hybrydyzacja Southern
(ang. Southern blot hybridization)
hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego fragmentu DNA,
najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA - DNA,
Hybrydyzacja Southern cd.
Etapy :
1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.
3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ.
Hybrydyzacja Southern cd.
4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy.
5. Związanie DNA z filtrem: w temperaturze 80°C lub poprzez naświetlanie UV.
6. Hybrydyzacja z sondą.
7. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.
Hybrydyzacja Southern cd.
Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:
1. Prehybrydyzacja:
- eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze,
- w celu zminimalizowania tła dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe.
2. Właściwa hybrydyzacja:
- wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi,
- wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze stężenie soli, dodatek formamidu,
- częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli.
3. Płukanie filtru:
- usunięcie niezhybrydyzowanej sondy - jest to warunek specyficznego obrazu hybrydyzacji.
Zastosowanie hybrytyzacji Southern
Hybrydyzacja Southern umożliwia:
- wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje) większych niż 50 pz,
- badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA - RFLP (restriction fragment length polymorphism).
Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc restrykcyjnych.
Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.
Hybrydyzacja Northern
(ang. Northern blot hybridization)
Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA).
Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów
(badanie ekspresji genów).
Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:
- rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach denaturujących,
przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,
utrwalenie RNA na membranie,
hybrydyzacja RNA z sondą,
odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.
Sonda daje syngał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na
membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można
ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.
Hybrydyzacja Dot - blot
DNA Fingerprinting
(genetyczny odcisk palca)
Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.
Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.
Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA.
Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) - zmienna liczba tandemowych powtórzeń.
Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.
DNA Fingerprinting cd.
Metedyka:
- trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych miejscach,
- rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny pocięte fragmenty DNA,
- przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,
- detekcja.
DNA Fingerprinting cd.
W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do kilkudziesięciu loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA fingerprint.
DNA Fingerprinting cd.
Zastosowanie:
- badania medyczno - sądowe,
- ustalanie ojcostwa.