Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

          Jeśli jeszcze nie mamy oczyszczonego preparatu DNA lub RNA to przed rozpoczęciem hybrydyzacji musimy dokonać izolacji. W przypadku, gdy materiałem badanym nie jest tkanka płynna tak jak np. krew, to musimy rozdrobnić taką tkankę. Homogenizujemy, więc tkankę, z której chcemy uzyskać materiał do analizy, czyli rozcieramy ją na jednolitą masę. Teraz poddajemy ją procesowi niszczenia i destabilizowania błon komórkowych, oczyszczania przez wirowanie i wytrącanie lub dodatkowe trawienie. Dokładniejsze informacje o ekstrakcji DNA znajdują się w innych działach, np. w pierwszym i ostatnim.
          Niezmiernie ważne jest tu zachowanie ostrożności by nie zanieczyścić próbki, nukleazami które zdegradują, czyli porozcinają nam interesujące nas cząsteczki kwasów nukleinowych. Nukleazy są jednak bardzo powszechne szczególnie te, które degradują RNA. Wszystkie komórki rybonukleazy gdyż enzymy te biorą udział w przeróżnych procesach związanych przemianami metabolicznymi RNA. Procesów takich w komórkach jest sporo a więc i ciągła mobilność RNA w strukturach komórkowych wywołuje, że komórki posiadają durzy potencjał usuwania zbędnego już RNA. Musimy się, więc przed tym ochronić. Robimy to za pomocą czynników dezaktywujących nukleazy. Jest nim najczęściej, DEPC czyli dietylopirowęglan.
          Może on być dodawany odczynników oraz myje się nim szkło i sprzęt, którym posługujemy się przy badaniu. Dzięki temu zapobiegamy niszczeniu kwasów nukleinowych przez nukleazy egzogenne, które możemy przenosić też rękoma. Pamiętamy jednak, że enzymy te znajdują się również wewnątrz komórek i przed nimi też musimy ochronić materiał przeznaczony do badań. Robimy to np. poprzez inkubację obróbki, z proteinazą K, lub traktowanie jej tiocyjanianem guanidyny, która denaturuje białka. Można też dodać związku takiego jak, merkaptoetanol, który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się badany materiał przed RNazami endogennymi.
          Detekcja poszukiwanego DNA odbywać się może za pomocą metody Southern blotting, natomiast w przypadku RNA analogiczna metodą jest Northern blotting. Metody te oparte są na podstawowej zdolności kwasów nukleinowych do tworzenia komplementarnych wiązań pomiędzy sobą. Stosowane sondy są zdolne do wybiórczego wiązania się z sekwencjami do nich komplementarnych. Hybrydyzacja pozwala specyficznie wykrywać interesujące nas sekwencje mimo obecności dużej ilości innych nie komplementarnych molekuł. Komplementarność jest w tym przypadku jako zależnym od sekwencji rozpoznawaniu się molekuł i ich wzajemne wiązanie. To tak jak w naturalnej dwuniciowej cząsteczce DNA, gdy dwie nici wiążą się ze sobą, ponieważ mają komplementarne sekwencje. Dzięki wiązaniu sondy z komplementarną do niej sekwencją powstają kompleksy "sonda-sekwencja komplementarna". Te kompleksy wykrywamy dzięki temu, że sonda jest wcześniej przezornie wyznakowana, radioaktywnie lub chemicznie.
          Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie następujących kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami. DNA-DNA, gdy jednoniciowe DNA (ssDNA) może dzięki parowaniu zasad tworzyć dwuniciowe hybrydy, w których ssDNA sondy wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji. DNA-RNA, gdy sonda, którą jest ssDNA może tworzyć dwuniciowe hybrydy z komplementarna cząsteczką, RNA, która jest z reguły jednoniciowa. Trzeci i ostatni rodzaj hybryd to RNA-RNA. Z hybrydyzacją sond wiążą się dwa pojęcia. Reakcja hybrydyzacji jest specyficzna, co oznacza, że sonda wiąże się tylko do sekwencji komplementarnej. Hybrydyzacja jest wybiórcza, czyli zachodzi pomiędzy komplementarnymi molekułami RNA mimo obecności dużej ilości molekuł nie komplementarnych. Tak, więc sonda może wiązać się wybiórczo do obiektu docelowego w roztworze bilionów spokrewnionych, lecz nie identycznych molekuł.
          Techniki hybrydyzacji są, nieocenione, ponieważ w komórce znajduje się tysiące genów i tysiące różnych mRNA. Jeśli teraz uwolnimy kwasy nukleinowe z komórki podczas ekstrakcji to całe DNA i RNA znajduje się specyficznego próbce. Analiza specyficznego genu lub jego produktu, czyli mRNA w takiej mieszaninie nie byłaby możliwa, jeśli nie potrafilibyśmy wykrywać konkretnej molekuły RNA lub DNA. Również najnowsze badania DNA przy zastosowaniu, mikromacierzy opierają swą zasadę o zjawisko specyficznej hybrydyzacji.
          Wydawać by się mogło, że wystarczy dodać do badanej próbki DNA wyznakowaną np. radioaktywnie sondę i otrzymamy wyniki po specyficznej hybrydyzacji. Jednak tu pojawia się problem gdyż po zmieszaniu roztworu analizowanego z radioaktywna sondą otrzymamy radioaktywną mieszaninę. Więc nie można określić, w których miejscach utworzyły się hybrydy. Dlatego też proces hybrydyzacji musi być poprzedzony rozdzieleniem mieszaniny DNA na oddzielne fragmenty. Odbywa się to w procesie elektroforezy w żelu. Kwasy nukleinowe musza być do tego procesu odpowiednio przygotowane by później odpowiednio reagować w procesie hybrydyzacji. Stosujemy, więc różne techniki przy usuwaniu struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych RNA i DNA. Podczas przygotowywanie DNA do metody Southerna tnie się go enzymem restrykcyjnym na fragmenty restrykcyjne, które mają jedynie strukturę pierwszorzędową. Natomiast RNA do metody Northerna również wymaga denaturacji w obecności formaldehydu, inne środki to, glyoxal/DMSO lub silnie trujący, methylmercuric chloride. I choć RNA jest jednoniciowe to jednak poprzez występowanie komplementarnych zasad mogą tworzyć się struktury drugorzędowe. W praktyce zwykle mniej niż 50% cząsteczki RNA pozostaje, jednoniciowa co stanowi bardzo dużym odstępstwie od struktury jednoniciowej. Teraz dopiero pozbawione struktur drugorzędowych próbki mogą zostać rozdzielone pod względem masy cząsteczkowej. Nie mają już struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych a więc ich wędrówka przez pory w żelu jest proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej. Pamiętać, więc należy, że w metodzie Southerna, DNA w żelu jest nadal dwuniciowe, tak, więc trzeba go będzie jeszcze denaturować przed hybrydyzacją, gdyż sonda wiąże się tylko do jednoniciowych struktur. Natomiast, RNA już w czasie elektroforezy znajduje się w postaci jednoniciowej, co bez dodatkowych zabiegów denaturacji umożliwia wiązanie się sondy.
          Pierwszy etap pracy z metodami hybrydyzacji fragmentów rozdzielonych na żelu to przygotowanie tego żelu. Żel przygotowujemy rozpuszczając agarozę w wodzie wolnej od nukleaz. Najczęściej przydatna staje się tu domowa kuchenka mikrofalowa. Mieszaninę mieszamy, co kilkadziesiąt sekund nie dopuszczając do całkowitego wrzenia. Oprócz rozpuszenia całej, agarozy musimy zwracać uwagę na odpowietrzenie roztworu. Po rozpuszczeniu agarozy pozostawiamy ją na kilka minut w temperaturze bliskiej 100°C. Do takiego roztworu dodajemy uprzednio ogrzany bufor, by różnica temperatury nie spowodowała miejscowego schłodzenia żelu. Teraz czekamy na przestygniecie żelu do około 50°C, po czym dodajemy formalinę, czyli 37% formaldehyd w przypadku RNA. Tak przygotowany żel jest gotowy do wylania na wanienkę elektroforetyczną, gdzie będzie tężał. Warstwa żelu nie może być zbyt gruba by umożliwić późniejsze etapy transferu kwasów nukleinowych z żelu na filtry.
          Przeprowadzamy teraz proces elektroforezy. Do uformowanych w żelu kieszonek napipetowujemy próbki do analiz wraz z bromkiem etydyny. Elektroforezę w tym przypadku przeprowadzamy przy niskim napięciu np. 18 godzin 5-20V. Przy tak długim procesie bufor wymaga mieszania, co kilka godzin i najlepiej, jeśli całość będzie prowadzona w warunkach chłodnych. Uzyskać to można na przykład poprzez trzymanie zestawu w kuwecie z lodem. Elektroforezę taką prowadzimy do czasu, aż barwnik bromophenol blue osiągnie 1/2 do 2/3 długości naszego żelu. Teraz żel taki może być oglądany pod transiluminatorem UV gdzie zobaczyć możemy pozycje naszych próbek poprzez świecenie się bromku etydyny.
          Kolejny etap to immobilizacja, czyli unieruchomienie, co jest niezbędne podczas hybrydyzacji. Chcąc po procesie elektroforezy przeprowadzić hybrydyzację musimy DNA lub RNA przenieść z żelu na membranę nylonową lub filtry nitrocelulozowe. Hybrydyzacja przeprowadzona w żelu nie dają zadawalających wyników ze względu na obecność utrudnień w mobilności kwasów nukleinowych w porach żelowych. Zjawisko to będące podstawą procesu elektroforezy nie pozwala na prawidłową hybrydyzacja. To właśnie ten proces przenoszenia i unieruchamiania kwasów nukleinowych nazywa się blotowaniem. Stąd tez nazwy Northern blot lub Southern blot. DNA i RNA przenosi się na membranę najczęściej poprzez transfer kapilarny, polega to na przemieszczaniu się wraz z strumieniem buforu przepływającego przez żel.
          Transfer taki, czyli "downwoard" przeprowadza się w odpowiednio wysokiej plastikowej wanience. Wanienka ta zawierać będzie bufor i dla tego na jej dnie kładziemy grubą warstwę bibuły lub plastikowy podkład by podwyższyć poziom, na którym będzie znajdował się cały transfer, co zapobiegnie jego zatopieniu. Teraz możemy wyłożyć kawałki zwilżonego buforem papieru Whatmana. Kawałki te powinny być znacznie większe od powierzchni żelu, z którego odzyskiwać będziemy materiał genetyczny. Na tę warstwę możemy położyć filtr, który powinien być większy od żelu, ale już niewiele. Na filtr nylonowy nakładamy żel, pamiętając by był on w takim położeniu, w jakim był wyciągnięty z aparatu do elektroforezy. Ważne jest by teraz zaznaczyć w jakiś sposób orientacje filtra i żelu w celu dokładnej i jednoznacznej interpretacji wyników. Dokładne ścisłe zetknięcie się filtra i żelu jest możliwe dzięki lekkiemu polaniu filtra rozcieńczonym buforem i dopiero nakładanie żelu. Teraz możemy przebić studzienki żelu i jednocześnie zaznaczając ich położenie na filtrze. Analogiczne warstwy papieru jak pod zestawem filtr-żel nakładamy na niego od góry. Te kolejne warstwy papieru Whatmana, powinny tym razem być dokładnie tej samej wielkości, co żel. Dokładamy na to jeszcze więcej kolejnych warstwy papieru. Te kolejne warstwy powinny mieć nadal szerokość żelu jednak tym razem powinny być o wiele dłuższe. Ich długość powinna pozwalać na zanurzenie końców w wanience z rozcieńczonym buforem SSC. Na całości transferu kładziemy mniejszą wanienkę z buforem i w niej zanurzamy długie końce papieru Whatmana. Jeśli dopilnujemy by nie zabrakło buforu to taki transfer trwa około 1-3 godziny w warunkach chłodniczych. Czas ten jest zróżnicowany i zależy od grubości i stężenia użytego żelu oraz od wielkości analizowanych fragmentów.
          Po skończonym transferze na powierzchnie filtra, możemy przystąpić do dalszej obróbki. Filtr po procesie transferu poddany musi zostać poddany immobilizacji przed procesem prehybrydyzacji. Odbywa się to poprzez 5 minutowe naświetlanie transiluminatorem i późniejsze osuszenie na powietrzu, przy czym papier lub bibułą pomogą przy odciąganiu wilgoci. Gdy filtr wyschnie owijamy go papierem i zapiekamy w 80°C przez około niecałą 1 godzinę.
          Dodanie teraz sondy spowoduje, że hybrydyzuje ona z badanymi próbkami oraz zwiążę się z cała powierzchnią filtra. Analizowanie takiego filtra wykazałoby, że cały jest pokryty radioaktywną sekwencją. Żeby temu zapobiec musimy zablokować, czyli wyłączyć wszystkie wolne miejsca na powierzchni filtra proces ten nazywamy prehybrydyzacją. Dokonujemy tego w ten sposób, że pozwalamy by cały filtr związał DNA lub RNA. Inkubuje się, więc go w roztworze zawierającym stężony DNA lub RNA. Prehybrydyzacją ta odbywa się w temperaturze około 45°C, przez czas około 5 godzin. Cała jego powierzchnia zostaje wtedy pokryta związanymi makromolekułami i nie może już więcej związać żadnej cząsteczki. Użyty roztwór, prehybrydyzacyjny ma taki sam skład jak hybrydyzacyjny z wyjątkiem braku sondy. W ten sposób filtr został nasycony i zablokowany.
          Możemy teraz przystąpić do zastosowania sondy. Sondy znakowane są najczęściej radioaktywnie. Przygotowanie takiej sondy polega na odzyskaniu przy pomocy trawienia z wektora molekularnego najczęściej plazmidu interesującej nas sekwencji. Fragmenty restrykcyjne, czyli matryce z wektora są następnie znakowane z użyciem losowych heksametrów. Znakowanie odbywa się poprzez syntezę nowych nici badanej poszukiwanej sekwencji na matrycy sekwencji z wektora. Denaturowane termicznie matrycowe DNA mieszamy z mieszanina losowych heksamerów, czyli fragmenty ssDNA o długości sześciu nukleotydów. Sekwencje te to wszystkie kombinacje, jakie mogą powstać z sześciu nukleotydów. Heksamery te parują ze wszystkimi komplementarnymi miejscami, jakie odnajdą na matrycy. Teraz możemy pozwolić by DNA polimeraza DNA rozpoczęła syntezę nowych nici przy pomocy cegiełek, dATP, dGTP, dTTP, dCTP niektóre radioaktywnego nich mogą być źródłem radioaktywnego pierwiastka. Radioaktywnym elementem jest tu zazwyczaj radioaktywny izotop fosforu, ³²P związany z cukrem. Emituje on promieniowanie ß o energii E =1,71 MeV (megawoltów). Inny pierwiastek to ³⁵S promieniujący falami ß o energii E =0,167 MeV, lub tryt ³H o sile promieniowania ß, E =0,018 MeV. Ważną informacją jest również okres półtrwania tych izotopów; 14,3 dnia dla ³²P, 87,1 dnia dla ³⁵S oraz 12,26 roku dla ³H.
          Sondę, którą odszywaliśmy musimy jeszcze oczyścić, aby pozbyć się niewłączonego do DNA izotopu oraz by usunąć zbyt krótkie radioaktywnych fragmentów. Zanieczyszczenia te mogłyby wiązać się w sposób niespecyficzny do membrany, co zafałszowałoby wyniki obserwacji. Teraz tuz przed hybrydyzacją ponownie mieszaninę poddajemy działaniu denaturującej temperatury gotując oraz mieszamy z buforem.
          Przystępujemy do właściwej hybrydyzacji. Dodajemy roztwór sondy wszystkich buforze do filtra wszystkich inkubujemy kilka godzin by dać czas wszystkim sondom odnaleźć swoje komplementarne sekwencje. Kinetyka tego procesu polega na wielokrotnym procesie asocjacji i dysocjacji. Związane jest to z temperatura topnienia, czyli takim punktem, w którym 50% długości sekwencji DNA jest rozpleciona. Hybrydyzacje przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze bliskiej 68°C a więc wyższej od Tm o jakieś 20°C - 25°C.
          Część sond nie odnajduje już wolnych sekwencji komplementarnych i nie wiąże się w strukturę hybryd. Jednak nadal znajduje się na filtrze, choć w formie niezwiązanej ani z kwasami nukleinowymi ani z filtrem. Możemy, więc niezwiązane sondy wypłukać przemywając filtr kilkakrotnie odpowiednimi buforami. Zabieg ten wydawać by się mogło mało skomplikowany może również mieć znaczenie analityczne. Wynika to z różnej ostrości płukania. Sondy, które odnalazły komplementarną sekwencje w 100% trzymają się jej najmocniej, jednak istnieją też takie, które związane są z badanym materiałem tylko w 90% czy 75% lub innych w zależności od stopnia homologii. Kontrolując siłę płukania możemy kontrolować specyficzność, która jest nam potrzebna w naszych badaniach. Na przykład, gdy poszukujemy analogicznych sekwencji u różnych gatunków nie zależy nam by były one identyczne w 100% o stopniu podobieństwa zadecydujemy później na razie szukamy jedynie podobnych odcinków. Ostrość płukania będzie wtedy mniejsza. To samo w przypadku mutacji.
          Po płukaniu mamy już tylko filtr z miejscami, w których sonda znalazła i związała się z komplementarnymi sekwencjami. By teraz takie miejsca ujawnić dla naszego narządu detekcji, czyli oka trzeba zastosować metody umożliwiające zmianę charakteru tego znacznika. Metodą to w przypadku promieniowania jest autoradiografia przy zastosowaniu kliszy rentgenowskiej. Przykładając filtr i kliszą do siebie powodujemy, że promienie niewidzialne dla nas oddziałują na czarna klisze wywołując rozjaśnienie w punktach gdzie znajduje się radioaktywna sonda a więc poszukiwana homologiczna sekwencja. Wywołanie takiej kliszy daje odwrócenie barw miejsca naświetlone przez promieniowanie to ciemne punkty na jasnym tle. Znając rozkład tych plam znamy rozkład DNA lub RNA na filtrze a to z kolei daje nam informacje o rozkładzie kwasów nukleinowych w żelu. Możemy jeszcze teraz odnaleźć takie miejsca i odzyskać z nich materiał o interesującej nas sekwencji do innych analiz.

Odnalezienie tego odcinka DNA, który pośród 3 miliardów nukleotydów zawartych w ludzkim genomie koduje interesujące nas białko, na pierwszy rzut oka graniczy z niemożliwością. Pomysłowość łowców ludzkich genów zaowocowała jednak opracowaniem co najmniej dwóch schematów postępowania, które skutecznie pozwalają osiągnąć wytyczony cel.

Pierwsza metoda poszukiwania sekwencji genetycznej oparta jest na znajomości produktu białkowego genu. W celu odnalezienia genu podjednostki beta hemoglobiny wystarczy posłużyć się retikulocytami z krwi obwodowej, w których obecny jest praktycznie tylko mRNA dla podjednostek hemoglobiny. W przypadku innych genów oczyszczone białko służy do przygotowania przeciwciał, co uzyskuje się przez immunizację zwierząt laboratoryjnych.

Kolejnym etapem jest pobranie z organizmu dostatecznie dużej liczby komórek, w których ma miejsce synteza białka i precypitacja homogenatu komórek przygotowanym przeciwciałem. Precypitat taki zawiera cały kompleks translacyjny (polisom), w którego skład wchodzą rybosomy, matryca mRNA oraz produkowany polipeptyd (rys. 1).

Inną, współcześnie często stosowaną metodą jest zbadanie fragmentu sekwencji aminokwasów oczyszczonego białka i synteza krótkiego jednoniciowego DNA (oligonukleotydu), który koduje odczytany fragment polipeptydu. Swoisty mRNA po oczyszczeniu może zostać przepisany w procesie odwrotnej transkrypcji na komplementarny DNA (cDNA), a następnie klonowany. Możliwe jest również wykorzystanie znakowanego mRNA, cDNA lub oligonukleotydu jako sondy genetycznej (p. dalej) do odnalezienia klonów zawierających poszukiwany gen.

Klonowanie w genetyce oznacza technikę pozwalającą otrzymać identyczne pod względem zawartości informacji genetycznej i zdolne do jej powielania struktury kwasów nukleinowych. Stopień złożoności takich struktur jest bardzo zróżnicowany. Najprostsze z nich, plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA, których wielkość nie przekracza zazwyczaj 10 000 par zasad. W naturze plazmidy są odpowiedzialne za przenoszenie cech genetycznych bakterii niezależnie od DNA jedynego ich chromosomu.

Wśród cech najmniej pożądanych z naszego punktu widzenia, oporność na antybiotyki jest typową własnością nabywaną przez bakterię w procesie zwanym transformacją, w którym plazmid z bakterii już opornej zostaje przekazany bakterii jeszcze wrażliwej. Selekcja tych bakterii, które nabyły odpowiednie plazmidy oporności antybiotykowej, jest częstą przyczyną niepowodzeń antybiotykoterapii.

Do badań naukowych wykorzystuje się plazmidy przygotowane w specjalny sposób, poprzez wymianę całych segmentów DNA. W skład ich struktury zawsze wchodzą przynajmniej 3 stałe elementy (rys. 2). Najważniejszym z nich jest miejsce początku replikacji (origin, ori), w którym następuje inicjacja procesu replikacji plazmidu. Sekwencja ori ogranicza namnażanie plazmidu do jednego gatunku bakterii gospodarza. Wyselekcjonowane jedynie do celów laboratoryjnych szczepy E. coli są niepatogenne, a ich szczególne właściwości są wynikiem nosicielstwa defektów genetycznych wykorzystywanych podczas klonowania.

Kolejne miejsce plazmidu, zasadnicze dla klonowania, to region, w który wprowadzono co najmniej kilka sekwencji nukleotydowych rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne (restryktazy). Endonukleazy restrykcyjne są rodziną bakteryjnych białek enzymatycznych, które potrafią ciąć DNA tylko w miejscach o ściśle ustalonej sekwencji nukleotydowej. To ograniczenie liczby miejsc, w których DNA ulega rozcięciu, ma swój głęboki sens biologiczny. Enzymy restrykcyjne powstały w drodze ewolucji jako forma obrony bakterii przed obcym DNA. Genom bakterii albo nie zawiera miejsc rozpoznawanych przez produkowane przez nie enzymy restrykcyjne, albo chroni je przed cięciem, na przykład dzięki metylacji nukleotydów.

W technikach molekularnych z miejsc restrykcyjnych korzysta się w celu precyzyjnego odcięcia interesującego fragmentu DNA, by na przykład można go było połączyć z inną cząsteczką poprzez enzymatyczną reakcję ligacji. Miejsca restrykcyjne noszą nazwy identyczne jak enzymy, które je rozpoznają. Nazwy enzymów pochodzą od gatunków bakterii je produkujących. Enzymy EcoRI i EcoRV to jedne z pierwszych oczyszczonych z E. coli; MspI pochodzi z Micrococcus species a TaqI z Termophilus aquaticus. Region plazmidu bogaty w miejsca restrykcyjne jest wykorzystywany w plazmidach do wbudowania obcego fragmentu DNA, czyli insertu. Miejsce to bywa często nazywane miejscem klonowania.

Trzecim niezbędnym atrybutem plazmidu jest gen selekcji, który powoduje, że bakterie, w których plazmid się replikuje, są "zainteresowane" jego utrzymaniem. Spośród kilku stosowanych genów oporności na antybiotyki najczęściej wykorzystywany jest gen beta-laktamazy, warunkujący oporność na penicyliny, gen fosfotransferazy aminoglikozydowej, warunkującej oporność na aminoglikozydy oraz gen acetylotransferazy chloramfenikolu. Jeśli do podłoża hodowlanego był dodany jeden z wymienionych antybiotyków, to w wyniku selekcji przeżyją tylko te bakterie, które mają plazmidy z odpowiednim genem oporności. Antybiotyk powoduje dodatkową amplifikację, czyli zwiększenie liczby kopii plazmidu w bakterii.

Klonowanie w plazmidach jest nadal jedną z najczęściej stosowanych technik, pozwalających w czasie kilku dni uzyskać nawet miligramowe ilości identycznych kopii DNA. Bywają jednak badania, w których liczy się nie tyle ilość, co różnorodność klonowanego DNA. W omawianym przykładzie genu hemoglobiny, wśród całkowitego RNA retikulocytów znajdowały się cząsteczki mRNA podjednostki beta-globiny. Problem techniczny polegał jednak na równoczesnej obecności innych cząsteczek mRNA, nawet zabieg immunoprecypitacji nie gwarantuje bowiem pełnego oczyszczenia, lecz jedynie wzbogacenie precypitatu w poszukiwane mRNA. Do wyizolowania pojedynczych cząsteczek kwasu nukleinowego, spośród ich mieszaniny, czyli do przygotowania klonów można się posłużyć innym nośnikiem (wektorem) DNA - bakteriofagiem.

Bakteriofagi są wirusami atakującymi bakterie metodą aktywnego wstrzyknięcia swojego DNA do wnętrza komórki. Materiał genetyczny fagów może się powielać w komórce, a po osiągnięciu dostatecznie dużej liczby cząsteczek wirusa (wirionów) spowodować ich uwolnienie poprzez lizę komórki. Cykl zakażenia jest tak szybki, że hodowla E. coli na stałym podłożu agarozowym w przypadku zakażenia fagami wykazuje charakterystyczne okrągłe "łysinki" w miejscach, w których pojedyncze fagi zapoczątkowały lawinowe namnażanie swoich kopii i lizę bakterii.

Aktywny mechanizm wprowadzania DNA przez bakteriofaga do wnętrza bakterii pozwala na dobudowanie do jego genomu dość dużych (do 50 000 nukleotydów) fragmentów obcego DNA, który łatwo się przedostanie i namnoży w hodowli E. coli. Zbiór klonów fagów wyizolowanych z pojedynczych łysinek zwany jest biblioteką. W zależności od źródła obcych fragmentów DNA biblioteka taka nosi nazwę genomowej (dla fragmentów genomu, czasem jest to nawet jeden tylko chromosom) albo biblioteki cDNA. Komplementarny DNA (cDNA) może być uzyskany przez odwrotną transkrypcję mRNA wyizolowanego z różnych komórek.

Obecnie bardzo często wykorzystuje się tkankowo swoiste biblioteki cDNA. W omawianym przykładzie gen beta-globiny został odszukany w bibliotece zbudowanej z cDNA retikulocytów, szczególnie bogatej w transkrypty tego genu.

Rozmiar biblioteki genetycznej to wielkość, która określa liczbę klonów w niej zawartych. Choć wiele klonów się dubluje, to owa biblioteka zawiera często kilka tysięcy różnych fragmentów (insertów) DNA. Biblioteka cDNA przygotowana tylko z jednej wyspecjalizowanej linii komórkowej zawiera mniej różnorodnych fragmentów aktywnych genów. Tym łatwiejsze jest odszukanie w niej właściwych fragmentów genu podjednostki globiny - są one po prostu najliczniej reprezentowane wśród klonowanego cDNA.

Coraz częściej używane są nowe wektory DNA, które nie mają swoich bezpośrednich protagonistów w naturze. Wyróżnić wśród nich należy sztuczne chromosomy. Wektory te można namnażać podobnie jak plazmidy w komórkach bakteryjnych, ponieważ bez insertu mają niewielką cząsteczkę (około 10 000 par zasad). Wyposażono je jednak w mechanizm, który po linearyzacji DNA i wbudowaniu insertu, a następnie transfekcji gospodarza podtrzymuje liniowy kształt cząsteczki. Umożliwia to ich replikację, zazwyczaj bez szczególnej amplifikacji liczby kopii, ale za to wraz z kilkuset tysiącami nukleotydów pochodzących z genomu człowieka.

Wariant bakteryjny wektora (bacterial artificial chromosome - BAC), czyli sztuczny chromosom bakterii oraz sztuczny chromosom drożdży (yeast artificial chromosome - YAC) służą lokalizacji nowych genów i poszukiwaniu nowych sond DNA (p. dalej). Wykorzystując YAC, można również doskonale badać ekspresję genów i białka mające wpływ na jej regulację, ponieważ w toku ewolucji zachowane zostało znaczne podobieństwo czynników kontrolujących transkrypcję u wszystkich Eucaryota.

Cząsteczka DNA, która została sklonowana, wymaga do pełnej charakterystyki odczytania sekwencji nukleotydowej DNA. Proces czytania sekwencji DNA, czyli sekwencjonowanie, realizowany jest najczęściej w oparciu o reakcję enzymatyczną. Klonowanie ułatwia uzyskanie dostatecznie dużej liczby identycznych cząsteczek, które są następnie w przebiegu sekwencjonowania kopiowane in vitro. W procesie tym wykorzystany jest enzym pochodzący z bakteriofaga - polimeraza T7. Kopiowanie dotyczy tylko jednej nici, ponieważ wykorzystywany jest tylko jeden starter zbudowany z około dwudziestu nukleotydów (oligonukleotyd).

Starterem nazywany jest oligonukleotyd zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych, którego sekwencja jest komplementarna w stosunku do badanej matrycy DNA lub RNA. Dodanie jednoniciowego nukleotydu do jednoniciowej matrycy - w przypadku DNA musi on zostać uprzednio zdenaturowany - powoduje odtworzenie w odcinku komplementarnym obu nici struktury podwójnej helisy, czyli hybrydyzację. Startery o długości ponad 18 nukleotydów w sposób wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją komplementarną, jeśli nawet pojedyncze kopie matrycy zmieszane są z milionami innych cząsteczek DNA. Koniec 3' przyłączonego startera wyznacza początek replikacji DNA.

Wśród innych substratów reakcji sekwencjonowania, do których należą trifosforany deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP), znajduje się domieszka ich analogów. Dideoksynukleotydy są pozbawione grupy hydroksylowej w pozycji 3' deoksyrybozy. Ich złudne podobieństwo pełni rolę ślepej uliczki, uniemożliwiając dalszą syntezę nici. Co więcej, zatrzymanie wydłużania łańcucha nukleotydowego następuje zawsze w pozycji zajmowanej przez ten sam dideoksynukleotyd.

Reakcja sekwencjonowania prowadzi do powstania mieszaniny cząsteczek DNA, w których jedna z nici jest niekompletna, ale zawsze na końcu 3' znajduje się jeden i ten sam dideoksynukleotyd (rys. 3). Techniką rozdziału na żelu denaturującym, w którym DNA wędruje w postaci pojedynczych nici, można otrzymać "drabinkę" sekwencyjną (rys. 4). Komplet 4 reakcji przeprowadzonych w obecności każdego z 4 dideoksynukleotydów daje po elektroforezie pełny odczyt sekwencji DNA. Współczesne urządzenia pozwalają uzyskać z jednego kompletu reakcji sekwencjonowania odczyt nawet 900 nukleotydów.

Stwierdzenie podczas diagnostyki hemoglobinopatii zamiany nukleotydów w sekwencjonowanym odcinku DNA wymaga wnikliwej analizy. Przede wszystkim należy wykazać, czy jej skutkiem jest zamiana aminokwasu. Kodowanie jednego aminokwasu przez kilka kodonów powoduje, że nie każda mutacja punktowa pociąga za sobą zamianę aminokwasu. Mutacja, która nie wywołuje zmiany sekwencji polipeptydu nosi nazwę mutacji konserwatywnej. Jeżeli zamiana aminokwasu spowodowana mutacją punktową nie wpływa na zmianę właściwości białka to mutacja nosi nazwę cichej.

Cichy allel zawiera natomiast taką mutację, która prowadzi do utraty własności katalitycznej białka enzymatycznego, w skład którego wchodzi zmieniony polipeptyd. Analiza sekwencji DNA genomowego często pozwala uchwycić różnice w regionach niekodujących genów. Nie wpływają one na ekspresję cech genetycznych, natomiast są chętnie badane w poszukiwaniu sprzężeń między chorobami a genami, w których obrębie występują.

W niedokrwistości sierpowatokrwinkowej zamiana adeniny na tyminę w 6 kodonie genu beta-globiny (numeracja nie uwzględnia kodonu startu, aminokwasu metioniny) powoduje zastąpienie glutaminy przez walinę. Mutację tę można zapisać jako Glu6Val lub E6V zależnie od użycia trój- lub jednoliterowych symboli aminokwasów (rys. 2), a także jako A17T, dotyczy bowiem 17 nukleotydu cDNA genu beta-globiny.

Zamiana naładowanego ujemnie aminokwasu na hydrofobową walinę sprzyja w warunkach niedotlenienia i kwasicy występowaniu agregacji hemoglobiny, co pociąga za sobą zmianę kształtu krwinek, hemolizę i zatorowość. Ta pierwsza wytłumaczona na poziomie molekularnym choroba jest najczęstszą w niektórych populacjach mutacją. Wśród Murzynów amerykańskich częstość jej nosicielstwa sięga 8%, a w Nigerii nawet 30%. Odziedziczenie dwóch alleli mających taką samą mutację zwane jest homozygotycznością.

W przypadku wyjątkowych wariantów allelicznych, których częstość jest mniejsza niż 1%, homozygotyczność pojawia się rzadziej niż u 1 osoby na 10 000. Dla genu beta-globiny homozygotyczność mutacji Glu6Val objawia się klinicznie niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Rozprzestrzenienie się tej choroby jest szczególnie dobitnym przykładem zwiększenia częstości rzadkich alleli wskutek doboru naturalnego. U ich podłoża leży malaria - najczęstsza śmiertelna choroba zakaźna na świecie. Nosicielstwo niedokrwistości sierpowatokrwinkowej zmniejsza ryzyko zachorowania na malarię. Ewolucja przyczyniła się do rozpowszechnienia tej mutacji na terenach objętych chorobą.

Klasyczna metoda poszukiwania genów na podstawie ich produktów białkowych, nazywana klonowaniem funkcjonalnym, w ostatniej dekadzie ustąpiła miejsca tak zwanej genetyce odwrotnej. W tej strategii poszukiwania genów odpowiedzialnych za choroby punktem wyjścia jest chromosomowa lokalizacja genu (klonowanie pozycyjne). Metoda ta jest jedyną możliwą w przypadku defektu genetycznego, dla którego nie jest znane nieprawidłowe białko (a tym samym nie jest znany mechanizm molekularny choroby). Niezbędnym warunkiem odkrycia genu takiej choroby jest znalezienie rodzin, w których zaburzenie genetyczne wystąpiło u kilku jej członków.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a, postępująca choroba, charakteryzująca się powolnym, nieodwracalnym zanikiem włókien mięśni szkieletowych, często z rzekomym powiększeniem mięśni spowodowanym przerostem tkanki tłuszczowej, jest chorobą występującą u chłopców. Sprzężenie dystrofii mięśniowej z płcią lokalizuje gen tej choroby na chromosomie X. W nielicznych przypadkach badanie cytogenetyczne wykazuje u chorych na dystrofię mięśniową delecję fragmentu chromosomu X, która zawsze obejmuje dystalny odcinek krótkiego ramienia tego chromosomu. Z punktu widzenia genetyki odwrotnej można zatem stwierdzić, że u części chorych, u których pojawia się cecha fenotypowa dystrofii mięśniowej typu Duchenne'a, występują ubytki materiału genetycznego w obrębie chromosomu X. Regiony chromosomów są precyzyjnie numerowane, na podstawie technik barwienia, w których na chromatydach pojawiają się prążki. Prążki są liczone od centromeru ku końcom chromatyd (telomerom), osobno dla każdego z ramion chromosomu. W przypadku delecji kojarzącej się z dystrofią mięśniową dotknięty jest zawsze prążek 21 na ramieniu krótkim chromosomu X (Xp21).

Dalszy etap badania obejmuje poszukiwanie w wyznaczonym regionie chromosomowym genów podlegających ekspresji. Istnieje wiele pomysłowych technik pozwalających szybko wyszukać geny zlokalizowane w regionie chromosomowym, który został wskazany na podstawie badania chromosomów (cytogenetycznego), czyli zawężony do kilku milionów par nukleotydów.

W dystrofii mięśniowej, która była jedną z pierwszych chorób genetycznych zdiagnozowanych molekularnie z wykorzystaniem strategii genetyki odwrotnej, posłużono się materiałem genetycznym od chorych z delecją. DNA uzyskany od chorych rozrywano ultradźwiękami. Fragmenty o długości kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów po zdenaturowaniu hybrydyzowano w roztworze z DNA, pochodzącym od mężczyzny, którego nieprawidłowy genom zawierał aż cztery kopie chromosomu X (rys. 5).

Sposób przygotowania tego DNA był inny niż od chorego z delecją - fragmenty otrzymano w wyniku trawienia enzymem restrykcyjnym. Po hybrydyzacji większość cząsteczek zawierała materiał pochodzący z obu źródeł DNA. Jedynie te fragmenty restrykcyjne chromosomu X, które nie mogły hybrydyzować z materiałem utraconym wskutek delecji, odzyskały swoją pierwotną strukturę cząsteczki (hybrydyzacja kompetycyjna), wraz z końcami powstałymi po trawieniu restrykcyjnym. Obecność końców utworzonych przez enzym restrykcyjny wykorzystano do klonowania fragmentów. Inserty te posłużyły następnie do analizy DNA pobranego od chorych, w tym również tych, u których pod mikroskopem nie była widoczna delecja chromosomu X.

Techniki hybrydyzacyjne, oparte na zdolności odtworzenia dokładnej dzięki komplementarności zasad struktury dwuniciowej cząsteczki DNA, są nadal powszechnie stosowane. Najczęściej bada się DNA unieruchomione na powierzchni nitrocelulozowej lub nylonowej w postaci pojedynczych nici. Innym wariantem badania jest takie utrwalenie skrawków tkanek lub rozmazów komórek, by przygotować kwasy nukleinowe do hybrydyzacji. Wariant ten nosi nazwę hybrydyzacji in situ. Druga część powstającej hybrydy znajduje się w roztworze i nosi nazwę sondy genetycznej.

Wykrycie sygnału sondy jest możliwe dzięki jej znakowaniu. Najbardziej czułą metodą znakowania sondy jest wbudowanie w trakcie jej przygotowania izotopu radioaktywnego. Chętnie stosowany jest izotop fosforu 32P, o dużej aktywności własnej i krótkim czasie rozpadu. Jest on wbudowywany w łańcuch nukleotydowy w formie trinukleotydowych substratów, najczęściej jako dCTP. Często stosowane komercyjne techniki hybrydyzacyjne w diagnostyce molekularnej modyfikowane są tak, by uniknąć ryzyka związanego z użyciem izotopu radioaktywnego. Wówczas najczęściej sondę znakuje się biotyną albo digoksygeniną.

Detekcja sygnału sondy radioaktywnej jest prostsza - powoduje ona zaczernienie kliszy radioaktywnej, co nazywa się autoradiografią. Sondy nieradioaktywne wymagają użycia przeciwciał skierowanych przeciwko biotynie lub digoksygeninie, dodatkowo sprzężonych z enzymem. Najczęściej enzymatyczne metody detekcji korzystają z peroksydazy chrzanowej (HRP) oraz fosfatazy alkalicznej (AP). Enzymy te w obecności odpowiednich substratów powodują powstanie kolorowych produktów (reakcja barwna)-???kolorymertria??? lub powodują emisję kwantów światła (chemiluminescencja).

Dobór strategii badawczej dla dystrofii Duchenne'a okazał się szczególnie trafny, ponieważ większość przypadków tej choroby spowodowana jest delecjami genu. Duże delecje, obejmujące kilkaset tysięcy par nukleotydowych, mogą być widoczne w mikroskopowym badaniu chromosomów, mniejsze powodują jedynie utratę sygnału sond genetycznych komplementarnych względem utraconego DNA. Wiele przypadków choroby spowodowane jest jednak niewielkimi delecjami, rzędu kilkuset nukleotydów. Dla ich ujawnienia niezbędne okazało się "rozciągnięcie" DNA genomowego metodą elektroforezy fragmentów powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

DNA nałożony na żel agarozowy zachowuje się jak ujemnie naładowana cząsteczka o dużej masie. Wędruje w kierunku anody (bieguna dodatniego), a migracja jest hamowana przez sieć agarozową proporcjonalnie do wielkości cząsteczki DNA. Miejsca cięcia rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne są w genomie ludzkim rozmieszczone przypadkowo. Wielkocząsteczkowy DNA poddany trawieniu enzymatycznemu endonukleazą restrykcyjną zostaje zamieniony w mieszaninę cząsteczek różniących się liczbą par nukleotydów. W czasie elektroforezy cząsteczki te są sortowane według wielkości.

Technika, która pozwoliła na wierne przeniesienie DNA z żelu na podłoże dostatecznie wytrzymałe, by można wykonać hybrydyzację, nosi nazwę Southern blot. Pierwszy człon nazwy tej techniki pochodzi od nazwiska jej wynalazcy, E.M. Southerna, drugi od pomysłu polegającego na wykorzystaniu zjawiska włosowatości dla wymuszenia wędrówki DNA, podobnie jak przy wciąganiu atramentowego kleksa przez bibułę. Biolodzy molekularni szybko nazwali transfer rozdzielonego elektroforetycznie RNA - Northern blot, a transfer białka - Western blot (rys. 6).

W wyniku hybrydyzacji rozdzielonego elektroforetycznie i związanego z podłożem (membraną) DNA sygnał sondy ma charakterystyczny wygląd prążka. Jego kształt odpowiada studzience żelu agarozowego. Intensywność prążka jest pochodną aktywności sondy, a prążków uzyskanych na tej samej membranie, czyli po hybrydyzacji z tą samą sondą - proporcjonalna do ilości komplementarnego DNA w materiale. Odległość prążka od miejsca startu elektroforezy wykazuje ścisłą zależność od wielkości cząsteczki DNA. Dla niewielkich delecji stwierdza się typowe przesunięcie prążka w kierunku mniejszych fragmentów, czyli przyspieszenie migracji.

Różnica ruchliwości elektroforetycznej między DNA pochodzącym od osoby zdrowej i od osoby z delecją pozwala często oszacować wielkość utraconego odcinka genu. W wariancie hybrydyzacji in situ transfer DNA nie jest potrzebny. Sygnał sondy pojawia się w obrębie komórek czy nawet struktur subkomórkowych, jak na przykład chromosomy. Możliwość badania przestrzennego rozmieszczenia DNA i RNA jest w technice in situ okupiona mniejszą czułością oraz trudnościami w ilościowej ocenie intensywności sygnału sondy.

Na koniec warto wspomnieć, że technika Southern blot bywa również użyteczna w wykrywaniu mutacji punktowych. We wspomnianej mutacji prowadzącej do niedokrwistości sierpowatokrwinkowej zamiana nukleotydów powoduje utratę miejsca trawienia enzymem restrykcyjnym MstII. Po hybrydyzacji DNA pochodzącego od nosiciela tej choroby, wcześniej trawionego restryktazą MstII, uzyskuje się prążek prawidłowy i prążek o większej masie. Obecność jednego prążka o większej masie świadczy o utracie miejsc restrykcyjnych w obu zmutowanych allelach, czyli o homozygotyczności. Zmiana sekwencji rozpoznawanej przez któryś spośród około 100 enzymów restrykcyjnych jest nierzadkim zjawiskiem, skrzętnie wykorzystanym w diagnostyce typowych mutacji punktowych.