Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (renaturacja). Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:

W przeszłości prędkość hybrydyzacji DNA wyizolowanego z genomów dwóch różnych organizmów była używana jako miara pokrewieństwa ewolucyjnego. W ten sposób na przykład ustalono po raz pierwszy, że szympans jest najbliższym ewolucyjnie krewniakiem człowieka

Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting, Southern blot) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca wykrywaniu określonych fragmentów DNA . Jej nazwa pochodzi od nazwiska E. Southerna, który ją opisał i przedstawił w roku 1975[1].

Aby ją wykonać, należy przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi), umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA. Następnie całość przenosi się na błonę nylonową. Po odpowiednim spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację z sondą, a następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji uwidacznia się interesujące nas fragmenty DNA. Metoda ta może być przeprowadzona w sposób pozwalający określić ilość DNA w badanej próbce. Wówczas siłę sygnału przekłada się na poziom DNA obecnego w badanej próbce.

Hybrydyzację Southerna można stosować m.in. po cięciu DNA enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało specyficznych starterów (zobacz: reakcja łańcuchowa polimerazy) lub też w celu wykrycia obcego DNA w badanym organizmie (np. DNA wirusa u człowieka).

Hybrydyzacja northern (ang. northern blotting) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do detekcji określonych sekwencji RNA. Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce.

Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southerna: (skąd też pochodzi nazwa metody, patrz niżej)

Jeżeli nie interesuje nas długość wykrywanego RNA, krok pierwszy (elektroforezę) można pominąć. Wówczas RNA nanosi się bezpośrednio na membranę.

Sonda daje na ogół sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Nazwa metody powstała jako gra słów z nazwą wcześniej znanej metody wykrywania określonych sekwencji kwasów deoksyrybonukleinowychhybrydyzacją Southerna[1] (która została opracowana przez brytyjskiego biologa molekularnego Edwina Southerna).

Szlak RecBCD

RecA promuje wymiane nici miedzy czasteczkami DNA gdy:

(i) jedna z czasteczek ma region ssDNA, do

ktorego mo>e sie wiazac recA

(ii) dwie czasteczki wykazuja co najmniej 50 pz

region niemal identycznej homologii

(iii) w obrebie rejonu homologii musi istniec wolny

koniec DNA, ktory inicjuje wymiane nici

Rybosomy bakterii i eukariontów

Rybosomy bakterii są mniejsze i wrażliwsze na inne toksyny niż ich eukariotyczne odpowiedniki (te różnice są wykorzystywane przez niektóre antybiotyki)

U prokariotów występują rybosomy 70S. Duża podjednostka (50S) zawiera 34 białka i dwie cząsteczki rRNA (5S rRNA i 23S rRNA), a mała podjednostka (30S) zawiera 21 białek i jedną cząsteczkę rRNA (16S rRNA).

U eukariontów występują rybosomy 80S oraz mniejsze rybosomy mitochondrialne i chloroplastowe przypominające rybosomy bakteryjne. Rybosomy 80S są zbudowane z dużej podjednostki (60S), która składa się z trzech cząsteczek rRNA (5S, 5.8S i 28S rRNA) oraz 49 białek, oraz małej podjednostki (40S), która składa się z 33 białek i jednej cząsteczki rRNA (18S rRNA).

Rybosomy chloroplastowe i mitochondrialne Przypominają rybosomy bakteryjne, co wspiera teorię endosymbiotyczną

U eukariontów można wyróżnić dwie lokalizacje rybosomów

Chaperony (Szaperony, Bialka opiekuńcze) - białka oddziałujące z fałdującym się białkiem, zapobiegające nieprawidłowym wiązaniom i eliminujące błędne struktury.

Chaperony wiążą się w sposób odwracalny z nie pofałdowanym odcinkiem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji lub błędnego fałdowania. Chaperony wiążą się z częściowo zwiniętymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny energetycznie. Pomagają białkom w uporządkowanym tworzeniu ich struktury przestrzennej. Jedna z rodzin chaperonów nazywana jest białkami szoku cieplnego. Należą do tej rodziny min Hsp60, Hsp70, BiP, GRP75, Hsp83, Grp94.

Spliceosom - kompleks białek i RNA, który bierze udział w wycinaniu intronów z pre-mRNA w procesie splicingu. Znane są dwa rodzaje spliceosomu. W skład klasycznego spliceosomu wchodzi pięć małych jądrowych nukleoprotein (snRNP, czyli białko + snRNA), zwanych U1, U2, U4, U5 i U6. Wycina on introny mające sekwencję GU na 5'-końcu i AG na 3'-końcu. Spliceosom alternatywny (typu U12) wycina introny zaczynające się od AU i kończące się AC. Również zawiera pięć rodzajów snRNP. Są to U11, U12, U4atac, U6atac, oraz - tak samo jak w spliceosomie klasycznym - U5.

Klasyczny spliceosom ma masę 12 MDa, z czego snRNA stanowią 3,3 MDa, a współtworzące snRNP białka - 2,2 MDa, co stanowi prawie połowę kompleksu. Ponadto spliceosom tworzą tzw. czynniki splicingu (~70) oraz inne białka (~30) niezbędne do związania RNA podlegającego splicingowi i katalizy procesu.


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, III rok, Genetyka kliniczna
hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych i jej zastosowanie w mikrobiologii
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, III rok, Genetyka kliniczna
BIOCHEMIA KWASOW NUKLEINOWYCH egzamin
dobroszycki,biochemia L, Izolacja kwasów nukleinowych z komórek?kterii
BIOCHEMIA KWASOW NUKLEINOWYCHegz
sprawozdanie 3, Właściwości białek i kwasów nukleinowych
Kartkówka Budowa i rola kwasów nukleinowych
BIAŁEK I KWASÓW NUKLEINOWYCH REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE
analiza kwasow nukleinowych
budowa i rola kwasów nukleinowych
Techniki izolacji kwasów nukleinowych
biochemia kwasow nukleinowych
Lekcja I Skladniki i struktura kwasow nukleinowych (powtorzenie podstawowych informacji
PORÓWNANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH
Budowa i funkcje kwasów nukleinowych

więcej podobnych podstron