Hybrydyzacja kwasów

Hybrydyzacja kwasów

nukleinowych i jej

nukleinowych i jej

zastosowanie w

zastosowanie w

zastosowanie w

zastosowanie w

mikrobiologii

mikrobiologii

dr n. wet. T. Dzieciątkowski

dr n. wet. T. Dzieciątkowski

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Jest to zjawisko spontanicznego łączenia się

Jest to zjawisko spontanicznego łączenia się
komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z

komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z
DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA).

DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA).

Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają

Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają
rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej

rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej
temperatury lub substancji chemicznych, takich jak

temperatury lub substancji chemicznych, takich jak

temperatury lub substancji chemicznych, takich jak

temperatury lub substancji chemicznych, takich jak
formamid lub mocznik.

formamid lub mocznik.

Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą

Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą
się ponownie (renaturacja).

się ponownie (renaturacja).

Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości

Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości
fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i

fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i
różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub

Hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub
chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy

chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy
molekularnej) używa się do detekcji homologicznych

molekularnej) używa się do detekcji homologicznych
fragmentów podczas:

fragmentów podczas:

poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w

poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w
przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.
do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną

do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną
detekcję cząsteczek mRNA w technice Northern.

detekcję cząsteczek mRNA w technice Northern.
do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema

do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema
próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.

próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.
do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice

do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice
hybrydyzacji

hybrydyzacji

in situ

in situ

..

do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southern

do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southern -- w

w

celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru

celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru
polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacji z sondami molekularnymi można poddawać

Hybrydyzacji z sondami molekularnymi można poddawać
całkowity DNA lub RNA wyizolowany z badanego

całkowity DNA lub RNA wyizolowany z badanego
materiału, unieruchamiany na nylonowych lub

materiału, unieruchamiany na nylonowych lub
nitrocelulozowych błonach w formie kropek (ang.

nitrocelulozowych błonach w formie kropek (ang.

dot

dot

blotting).

blotting).

Detekcja sygnału świadczy o rozpoznaniu przez sondę

Detekcja sygnału świadczy o rozpoznaniu przez sondę
komplementarnej sekwencji nukleotydowej, dowodząc

komplementarnej sekwencji nukleotydowej, dowodząc

komplementarnej sekwencji nukleotydowej, dowodząc

komplementarnej sekwencji nukleotydowej, dowodząc
istnienia w badanym materiale obcego gatunkowo,

istnienia w badanym materiale obcego gatunkowo,
patogennego kwasu nukleinowego.

patogennego kwasu nukleinowego.
W tym typie hybrydyzacji możliwa jest sytuacja odwrotna,

W tym typie hybrydyzacji możliwa jest sytuacja odwrotna,
kiedy to sonda jest unieruchomiona na trwałym podłożu, a

kiedy to sonda jest unieruchomiona na trwałym podłożu, a
badany materiał dodawany jest w roztworze

badany materiał dodawany jest w roztworze
hybrydyzacyjnym.

hybrydyzacyjnym.
Hybrydyzacja typu „dot blot" znajduje ograniczone

Hybrydyzacja typu „dot blot" znajduje ograniczone
zastosowanie, gdyż jej czułość może być niewystarczająca.

zastosowanie, gdyż jej czułość może być niewystarczająca.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Zasada metody i wynik hybrydyzacji typu „dot blot”

Zasada metody i wynik hybrydyzacji typu „dot blot”

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub

Hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub
chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy

chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy
molekularnej) używa się do detekcji homologicznych

molekularnej) używa się do detekcji homologicznych
fragmentów podczas:

fragmentów podczas:

poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w

poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w
przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.
do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną

do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną
detekcję cząsteczek mRNA w technice Northern.

detekcję cząsteczek mRNA w technice Northern.
do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema

do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema
próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.

próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.
do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice

do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice
hybrydyzacji

hybrydyzacji

in situ

in situ

..

do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southern

do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southern -- w

w

celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru

celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru
polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting) to

Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting) to
metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca

metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca
wykrywaniu określonych fragmentów DNA .

wykrywaniu określonych fragmentów DNA .

W celu wykonania hybrydyzacji typu Southern, należy

W celu wykonania hybrydyzacji typu Southern, należy
przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny

przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny
fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi),

fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi),
umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA.

umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA.

umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA.

umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA.
Następnie całość przenosi się na błonę nylonową. Po odpowiednim

Następnie całość przenosi się na błonę nylonową. Po odpowiednim
spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację

spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację
z sondą, a następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji

z sondą, a następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji
uwidacznia się interesujące nas fragmenty DNA. Metoda ta może

uwidacznia się interesujące nas fragmenty DNA. Metoda ta może
być przeprowadzona w sposób pozwalający określić ilość DNA w

być przeprowadzona w sposób pozwalający określić ilość DNA w
badanej próbce. Wówczas siłę sygnału przekłada się na poziom

badanej próbce. Wówczas siłę sygnału przekłada się na poziom
DNA obecnego w badanej próbce.

DNA obecnego w badanej próbce.
Hybrydyzację Southern można stosować m.in. po cięciu DNA

Hybrydyzację Southern można stosować m.in. po cięciu DNA
enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało

enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało
specyficznych starterów lub też w celu wykrycia obcego DNA w

specyficznych starterów lub też w celu wykrycia obcego DNA w
badanym organizmie

badanym organizmie

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja Northern (ang. Northern blotting) to metoda

Hybrydyzacja Northern (ang. Northern blotting) to metoda

stosowana w biologii molekularnej, służąca detekcji RNA.

stosowana w biologii molekularnej, służąca detekcji RNA.

Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów

Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów

ulegających transkrypcji w komórce.

ulegających transkrypcji w komórce.
Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southern:

Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southern:

RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (elektroforezie)

RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (elektroforezie)

na żelu

na żelu
po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz

po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz

utrwala na niej

utrwala na niej

po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz

po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz

utrwala na niej

utrwala na niej
membranę z RNA inkubuje się z sondą, tzn. cząsteczką DNA lub

membranę z RNA inkubuje się z sondą, tzn. cząsteczką DNA lub

RNA, która po pierwsze jest komplementarna do poszukiwanej

RNA, która po pierwsze jest komplementarna do poszukiwanej

sekwencji, a po drugie daje się łatwo wykryć

sekwencji, a po drugie daje się łatwo wykryć
po inkubacji i odpłukaniu nadmiaru sondy przeprowadza się

po inkubacji i odpłukaniu nadmiaru sondy przeprowadza się

detekcję, czyli uwidacznianie sondy, która związała się do

detekcję, czyli uwidacznianie sondy, która związała się do

poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.

poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.
jeżeli nie interesuje nas długość wykrywanego RNA, elektroforezę

jeżeli nie interesuje nas długość wykrywanego RNA, elektroforezę

można pominąć. Wówczas RNA nanosi się bezpośrednio na

można pominąć. Wówczas RNA nanosi się bezpośrednio na

membranę.

membranę.
sonda daje na ogół sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego

sonda daje na ogół sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego

na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można

na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można

ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

FISH (ang. fluorescence

FISH (ang. fluorescence

in situ

in situ

hybridization) jest techniką

hybridization) jest techniką

cytochemiczną polegającą na hybrydyzacji sekwencji DNA lub

cytochemiczną polegającą na hybrydyzacji sekwencji DNA lub
RNA ze specyficznymi sondami znakowanymi barwnikami

RNA ze specyficznymi sondami znakowanymi barwnikami
fluorescencyjnymi.

fluorescencyjnymi.

Dzięki reakcji sonda

Dzięki reakcji sonda –

– DNA jesteśmy w stanie określić pozycję

DNA jesteśmy w stanie określić pozycję

markera, czyli specyficznej, zazwyczaj oligonukleotydowej

markera, czyli specyficznej, zazwyczaj oligonukleotydowej
sekwencji, na badanej nici DNA. Określenie

sekwencji, na badanej nici DNA. Określenie

in situ

in situ

wskazuje na

wskazuje na

sekwencji, na badanej nici DNA. Określenie

sekwencji, na badanej nici DNA. Określenie

in situ

in situ

wskazuje na

wskazuje na

miejsce przeprowadzania reakcji hybrydyzacji, którym jest

miejsce przeprowadzania reakcji hybrydyzacji, którym jest
naturalne środowisko występowania DNA (chromosomy,

naturalne środowisko występowania DNA (chromosomy,
komórki).

komórki).

Obserwacja reakcji sondy z komplementarną sekwencją DNA,

Obserwacja reakcji sondy z komplementarną sekwencją DNA,
jest możliwa dzięki wyznakowaniu sondy fluorochromem, który

jest możliwa dzięki wyznakowaniu sondy fluorochromem, który
pod wpływem wzbudzenia światłem (UV

pod wpływem wzbudzenia światłem (UV--VIS) emituje

VIS) emituje

promieniowanie. Do analizy badanego materiału wymagany

promieniowanie. Do analizy badanego materiału wymagany
jest mikroskop fluorescencyjny.

jest mikroskop fluorescencyjny.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Wynik hybrydyzacji FISH w mikroskopie fluorescencyjnym

Wynik hybrydyzacji FISH w mikroskopie fluorescencyjnym

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Wynik hybrydyzacji

Wynik hybrydyzacji

in situ

in situ

w mikroskopie świetlnym

w mikroskopie świetlnym

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Zastosowanie Rekomendowany

typ membrany

Powód

Southern

Naładowany
nylon>nylon>nitroceluloza

transfer alkaliczny
jest wygodny dla
wiązań

Rekomendowane typy membran w metodach hybrydyzacji

Rekomendowane typy membran w metodach hybrydyzacji

wiązań
kowalencyjnych

Northern

Nylon>nitroceluloza

silne wiązanie
kowalencyjne
pozwala na
wielokrotne użycie

Krótkie kwasy
nukleinowe

Aktywowane bibuły

Jedyny rodzaj dla
cząstek <100 bp

Sondy
nieradioaktywne

Nitroceluloza>>>nylon

Niższe tło wiązania

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Czynnik

Wpływ na T

m

Siła jonowa

T

m

zwiększa się o 17

o

C w przypadku

Czynniki wpływające na T

Czynniki wpływające na T

m

m

hybryd kwasów nukleinowych

hybryd kwasów nukleinowych

Siła jonowa

T

m

zwiększa się o 17 C w przypadku

podwojenia stężenia monowalentnych
kationów

Skład zasad

Pary A-T są mniej stabilne niż pary G-C w
wodnych roztworach zawieracjącyh NaCl

Czynniki destabilizacyjne

1% formamidu redukuje T

m

o 0,6

o

C

6M mocznik redukuje T

m

o 30

o

C

Niepasujące pary zasad

T

m

obniża się o 1

o

C dla każdego 1%

niepasujących par zasad

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Czynnik

Wpływ na stopień hybrydyzacji

Temperatura

Optymalna hybrydyzacja zachodzi przy temp. o
15-25

o

C niższej od T

m

hybryd

Czynniki wpływające na stopień hybrydyzacji kwasów nukleinowych

Czynniki wpływające na stopień hybrydyzacji kwasów nukleinowych

15-25

o

C niższej od T

m

hybryd

Siła jonowa

Optymalna hybrydyzacja zachodzi przy 1,5M Na

+

Czynniki
destabilizacyjne

50% formamid nie ma wpływu, jednak niższe lub
wyższe stężenie obniża hybrydyzację

Złożoność sondy

Sekwencje repetytywne zwiększają hybrydyzację

Skład zasad

Niewielki wpływ

pH

Niewielki wpływ pomiędzy pH 5.0 a 9.0