Techniki izolacji

kwasów

nukleinowych

Podstawowe zasady

Pierwszym etapem jest
liza komórek w celu
preparacji jądra
komórkowego. Następnie
błona jądrowa ulega
dezintegracji, po to, aby
kwasy nukleinowe
przeszły do roztworu
wodnego. Do tych etapów
stosujemy jonowe
detergenty, tj. sól sodowa
siarczanu dodecylu (SDS).

Podstawowe zasady

cd.

W celu uzyskania czystego
preparatu kwasów
nukleinowych, należy oddzielić
związane z nimi białka.
Przeprowadzamy to za pomocą
ekstrakcji rozpuszczalnikami
organicznymi, np. fenol. Aby nie
uszkodzić DNA
przeprowadzamy kilkuetapową
ekstrakcję z różnymi
rozpuszczalnikami: fenol,
chloroform, alkohol izoamylowy.

Elektroforeza

Jej istotą jest rozdzielenie
mieszaniny związków
chemicznych na możliwie
jednorodne frakcje przez
wymuszanie wędrówki ich
cząsteczek w polu elektrycznym.
Wyróżniamy trzy rodzaje:

• Kapilarna;
• Żelowa;
• Bibułowa (nie używana).

Do wyizolowania kwasów
nukleinowych stosuje się min:

•Chloroform

•Alkohol izoamylowy

•Złoża krzemionkowe

Lipidy usuwamy dzięki ekstrakcji chloroformem.
Ekstrakcję chloroformem wykonujemy
przeważnie bezpośrednio po ekstrakcji fenolem,
gdyż chloroform oprócz lipidów i białek
usuwa z fazy wodnej również resztki fenolu

Usunięcie zdegradowanych
elementów komórkowych
następuje
poprzez ekstrakcję
fenolem* i chloroformem.

Chloroform powoduje również
powierzchniową denaturację białek.

*Jednak źle usunięty fenol może być inhibitorem w późniejszej reakcji amplifikacji.

Alkohol izoamylowy redukuje pienienie
i stabilizuje granicę fazową,
gdzie koncentruje się białko.

Usuwa ze środowiska uszkodzone DNA.

W celu ułatwienia prac związanych z badaniem

kwasów nukleinowych, firmy biotechnologiczne

sprzedają specjalne kolumny

do izolacji i oczyszczania DNA i RNA.

Systemy te na ogół oparte są zdolności

złóż krzemionkowych

do wiązania kwasów nukleinowych

w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych,

takich jak chlorowodorek guanidyny

lub izothiocjanian guanidyny.

Uzyskany zastosowaniem membran
i żywic krzemionkowych DNA,
charakteryzuje się
bardzo wysokim stopniem czystości
i może być wykorzystany
do analizy restrykcyjnej,
sekwencjonowania, ligacji i in

Membrany krzemionkowe są umieszczone
w pojedynczych naczyniach (skala mikro),
w postaci 96-dołkowej
oraz w kolumnach (skala midi i maxi).
Procedura wykorzystująca membranę silikonową
opiera się na zasadzie związania i wymycia.
DNA wiąże się do membrany
w obecności soli chaotropowych,
natomiast wszystkie zanieczyszczenia
(polisacharydy, barwniki i in.)
pozostają niezwiązane.

Żywica jonowymienna JETSTAR została wynaleziona
i opatentowana przez GENOMED.
Służy ona do uzyskiwania ultra czystego
kosmidowego i plazmidowego DNA,
wolnego od endotoksyn.
DNA oczyszczone przez JETSTAR
może być wykorzystywane
do transfekcji, mikroiniekcji, 
sekwencjonowania fluorescencyjnego.

Bibliografia:

• Wybrane techniki i metody analizy DNA, Zuzanna Nowak,

Joanna Gruszczyńska

• Świat wiedzy, tom Ciało człowieka
• Świat wiedzy, tom Nauka i technika
• Życie Świata, tom Życie i technika
• http://www.molcell.amu.edu.pl/izolacja%20DNA.pdf
• http://bgmo.jrc.ec.europa.eu/home/documents/manual

%20PL/Rozdzial04_PL.pdf