Izolacja kwasów nukleinowych:

parametry izolacji warunkujące

zachowanie natywnej struktury DNA

Monika Surówka

Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których

otrzymuje się DNA biologicznie aktywny, chemicznie
stabilny oraz wolny od RNA i białek. DNA w komórce
występuje w postaci kompleksu nukleinowo- białkowego
(DNP). Izolacja zmierza więc do rozerwania tego kompleksu
i wyodrębnienia DNA w stanie możliwie niezmienionym.
Jednak ze względu na wielkość i wrażliwość
chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego
izolacja w takim stanie. Część DNA ulega mechanicznym
uszkodzeniom.

Opracowanie procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy

na temat jego chemicznej stabilności i warunków w jakich
znajduje się w swoim naturalnym środowisku ( komórka).

Parametry warunkujące zachowanie

natywnej struktury DNA podczas

izolacji.

1. pH

pH ma istotne znaczenie, jeśli chodzi o stabilność

poszczególnych wiązań w cząsteczce DNA:

wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami

są stabilne w środowisku o pH = 4 - 10

wiązania fosfodiestrowe w szkielecie DNA są trwałe w zakresie

pH=

3-12

wiązania N- glikozydowe z zasadami purynowymi( adeniną i

guaniną) ulegają hydrolizie przy pH<3

2. temperatura

• Istnieją znaczne różnice w stabilności termicznej wiązań

wodorowych w podwójnej spirali, ale większość DNA ulega
rozpleceniu w temperaturze 80- 90 C.

• Wiązania N- glikozydowe i fosfodiestrowe są trwałe do 100

C

• enzymy specyficzne degradujące DNA( DNazy) ulegają

zniszczeniu przy podgrzaniu już do 65 C, dlatego
wyizolowanie i przechowywanie DNA jest stosunkowo
proste, inaczej jest w przypadku RNA, gdzie rybonukleazy
są niezwykle stabilne, nawet po całkowitej denaturacji
mogą ponownie fałdować i nabyć aktywność

3. siła jonowa

• DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli

• W stężeniu soli mniejszym niż 0,1 M osłabiają się wiązania

wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami

4. warunki komórkowe

• przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie ściany

komórkowej i liza błon komórkowych; łatwość rozbicia ściany

zależy od rodzaju organizmu, w niektórych przypadkach

konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie

ultradźwiękami( np. komórki drożdży czy tytoniu), podczas

gdy w innych (np. E. coli) możliwa jest enzymatyczna

hydroliza ściany komórkowej

• w komórce występuje kilka enzymów, które hydrolizują DNA,

najistotniejszymi z nich są deoksyrybonukleazy, które

hydrolizują wiązania fosfodiestrowe

• natywny DNA występuje w komórkach w kompleksie z

białkami( histony, helikazy, polimerazy i inne), bialka te

muszą być oddzielone podczas ekstrakcji

• obecność reszt fosforanowych sprawia, że kwasy

nukleinowe są jednorodne i silnie naładowane ujemnie, z
tego względu preferują środowisko wodne, inne składniki
komórki( białka, tłuszcze, węglowodany) zawierają zarówno
elementy naładowane jak i nienaładowane, stąd ich
preferencja do środowiska organicznego, wodnego lub
strefy na ich granicy

• kwasy nukleinowe ze względu na obecność dużych atomów

fosforu, są cząsteczkami o dość wysokiej gęstości, dlatego
mogą być oczyszczane w gradiencie chlorku cezu

5. odporność mechaniczna

DNA

• łagodne manipulowanie nie zawsze jest możliwe podczas

izolacji DNA, ucieranie, wytrząsanie, mieszanie i inne
czynności mechaniczne mogą spowodować rozszczepienie
DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorzędowej
struktury DNA, ale zmniejsza długość cząsteczki –
fragmentacja.

Pobieranie materiału

biologicznego.

Przechowywanie i przewożenie

próbek.

Prawidłowe pobranie materiału biologicznego, izolacja
DNA, charakterystyka i przechowywanie DNA stanowią
jeden z najważniejszych etapów pracy z DNA. Szczególnie
ważny jest etap izolacji DNA, który musi zapewnić wysoką
jakość preparatu DNA, umożliwiającą wykonanie dalszych
analiz.

Materiał biologiczny wykorzystywany do

izolacji DNA

• w przypadku człowieka i zwierząt:
- pełna krew obwodowa
- komórki nabłonka
- hodowla fibroblastów
- komórki płynu owodniowego, kosmówki
- cebulki włosów

rzadziej stosowanym materiałem wyjściowym są :
- plazmy krwi, nasienia
- fragmenty tkanek pobranych metodą biopsji cienkoigłowej
- szpik kostny
w przypadku materiału archiwalnego i wykopaliskowego

wykorzystuje się czaszkę, kości i zęby

• w przypadku roślin do izolacji DNA wykorzystuje się
- liście
- młode siewki

Izolacja DNA powinna być rozpoczęta zaraz po pobraniu materiału.

Tkanki mogą być wprawdzie przechowywane w temp. +4 C przez

kilka dni bez widocznej degradacji DNA, jednak wskazane jest aby

materiał, który nie jest poddany izolacji w ciągu 48 godz. od

pobrania, zamrozić i przechowywać w temp. -20 C lub – 80 C.

Szczególną uwagę należy zwrócić na zabezpieczenie materiału w

czasie przewożenia i przechowywania. Jest to bardzo ważne w

badaniach, medyczno-sądowych, jak i pracach hodowlanych,

ponieważ materiał badawczy jest wtedy unikatowy i najczęściej

nie

można go ponownie uzyskać.
Materiał do badań molekularnych można przechowywać
w 3 postaciach, jako:
1. zamrożoną tkankę
2. lizat umieszczony w buforze( bufor do lizy: 100mM
Tris-HCL, 40 mM EDTA, 0,2% SDS, pH 8,0).
3. wyizolowany preparat DNA

Literatura:

• L.

Kłyszejko – Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii,

Warszawa 1980, PWN

• A. Jerzmanowski, K. Staron, Podstawy inżynierii

genetycznej,

Warszawa 1979, WSiP
• R. Słomski, Analiza DNA- teoria i praktyka, Poznań

2008

• T. Mazurczak, Genetyka medyczna, Warszawa 1998,

Wydawnictwo Lekarskie PZWL