IG.1 - Techniki izolacji kwasów nukleinowych, Genetyka, Inżynieria genetyczna


Ćwiczenie 1 (26.02.2010)

''Techniki izolacji kwasów nukleinowych"

Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:

- budowa i funkcje kwasów nukleinowych;

- właściwości fizyko-chemiczne kwasów nukleinowych;

- techniki izolacji kwasów nukleinowych;

Głównym celem ćwiczeń będzie przeprowadzenie izolacji kwasów nukleinowych z materiałów biologicznych różnego pochodzenia i różnym sposobie przechowywania. Izolacje przeprowadzone zostaną z zastosowaniem różnych znanych metod i wykorzystywanych powszechnie zestawów do izolacji. W końcowym etapie ćwiczeń zostaną przeprowadzone pomiary absorbancji (Nanodrop) i określone wydajności izolacji. Jakość wyizolowanych kwasów nukleinowych zostanie określona na Ćwiczeniach 2 (elektroforeza genomowego DNA/RNA i elektroforeza pulsacyjna, pokazujące stopień uszkodzenia i degradację kwasów nukleinowych).

Materiały:

- osady komórkowe (zawieszone w buforze 1 x PBS) linii nowotworowych K562, HCT116 p53+/+ i HCT116p53-/-;

- wątroba szczurza mrożona i utrwalona w 4% formalinie;

- miesień szkieletowy szczurzy mrożony;

- zestawy do izolacji DNA/RNA formy A&A Biotechnology i Fermentas;

- odczynniki do przeprowadzenia izolacji DNA metodą z wykorzystaniem fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego

Wykonanie:

1. Każda z sekcji (1:6 i 7:12) otrzyma jeden typ materiału, z którego przeprowadzi izolację kwasów nukleinowych wskazaną techniką:

- izolacja DNA z rożnych tkanek i komórek przy użyciu mieszaniny fnol:chloroform:alk.izoamylowy;

- izolacja DNA z różnych tkanek i komórek przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji (Fermentas, A&A Biotechnology);

- izolacja RNA przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji (A&A Biotechnology);

- izolacja RNA metoda Chomczyńskiego (teoretycznie).

2. Pomiar absorbancji wyizolowanych kwasów nukleinowych i porównanie wydajności izolacji.

3. Zaliczenie ćwiczeń na podstawie zbiorczego zestawienia porównawczego wydajności izolacji, dla różnych materiałów biologicznych i technik izolacji (w formie protokołu).

Podział sekcji /materiałów/technik izolacji:

Sekcja

Materiał

Protokół

1,7

osady komórkowe (K562 lub HCT 166)

A

2,8

osady komórkowe (K562 lub HCT 166)

B

3,9

homogenaty mrożonych mięśni somatycznych szczura

A

4,10

homogenaty mrożonych mięśni somatycznych szczura

B

5,11

homogenaty mrożonych wątrób szczurzych

A

6,12

homogenaty, utrwalonych w 4% formalinie, wątrób szczurzych

A

Protokół A (izolacja DNA)

Odczynniki:

Wykonanie:

Zamrożone osady komórkowe lub zamrożone/utrwalone tkanki umieszczano w roztworze soli fizjologicznej 1 x PBS ręcznie rozdrabniano homogenizatorem tłokowym przez 2 minuty w temperaturze 0-2°C. Otrzymaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 700 × g w temperaturze 4°C. Osad wstępnie oczyszczonych jąder komórkowych przemywano roztworem 1 x PBS i wirowano jak wyżej.

  1. Osad jąder komórkowych zawiesić w ok. 600 µl buforu B, następnie dodać:

- 2 µl rybonukleazy A (do stężenia 0,5 mg/ml),

- 4 µl rybonukleazy T1 (do stężenia 100 jednostek Kunitza/ml);

- 15 µl 20% SDS (do stężenia 0,5 %)..

Mieszaninę inkubować 30 minut w temperaturze 37°C.

  1. Następnie dodać proteinazę K (20 µl - prowadzący), inkubację prowadzić 30 min w 50°C.

  1. Przeprowadzić odbiałczanie równą objętością, ok. 600 µl mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy.

  1. Mocno wytrzasnąć i wirować 15 min przy max. Obrotach (4000 RCF).

  1. Fazę wodną przenieść do nowej probówki i ponownie ekstrahować rowna objętością mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy. Wytrzasnąć i zwirować j/w.

  1. Fazę wodną przenieść do nowej próbówki i wytrącić z niej DNA podwójną objętością zmrożonego etanolu dodawanego do stężenia końcowego ok. 70 % (całość nie powinna przekroczyć objętości 1,5 ml).

  1. Wytrącony DNA przemyć świeżą porcją 70 % etanolu. Po osuszeniu osad rozpuścić w 20 μl wody dejonizowanej. Przechowywać w +4°C.

Protokół B (izolacja DNA)

Odczynniki:

Wykonanie:

1. Zawiesiny komórkowe (<106) lub homogenaty z tkanek zwirować 10 min przy 7000 RPM

2. Usunąć nadsącz, osady zawiesić w 100 μl buforu Tris (10 mM TrisHCL pH 8.5).

4. Dodać 200 μl buforu do lizy LT i 20 μl Proteinazy K (prowadzący).

5. Wytrząsać przez 20 s.

6. Inkubować w 37 °C przez 20 min.

7. Przenieść probówki do 70 °C, inkubować przez 5 min.

8. Wytrząsać przez 20 s.

9. Następnie wirować przez 2 min przy 10 000 - 14 000 RPM.

10. Przenieść nadsącz na złoże kolumny do izolacji.

11. Wirować przez 1 min przy 10 000 - 14 000 RPM.

12. Dodać na kolummnę 500 μl roztworu płuczącego A1.

13. Wirować 1 min przy 10 000 - 14 000 RPM (wylać zawartość dolnego zbiorniczka).

14. Dodać na kolumnę 400μl roztworu płuczącego A1.

15. Wirować 2 min przy 10 000 - 14 000 RPM (wylać zawartość dolnego zbiorniczka.

16. W celu odpłukania DNA ze złoża przenieść kolumnę do nowej probówki eppendorf (1.5 ml) i dodac na złoże 50 μl buforu Tris lub wody (podgrzanych wcześniej do 75 °C).

17. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.

18. Wirować przez 1 min przy 10 000 - 14 000 RPM.

19. Zebrany na dnie probówki roztwór DNA przechowywać w +4°C.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Techniki izolacji kwasów nukleinowych
Techniki izolacji kwasów nukleinowych
BUDOWA KWASÓW NUKLEINOWYCH, Genetyka
dobroszycki,biochemia L, Izolacja kwasów nukleinowych z komórek?kterii
Izolacja kwasów nukleinowych
IZOLACJA KWASOW NUKLEINOWYCH 2013
Izolacja kwasów nukleionocy materiały do ćw
IG.2 - Ocena stopnia degradacji kwasów nukleinowych poprzez rozdział elektroforetyczny, Genetyka, In
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, III rok, Genetyka kliniczna
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, III rok, Genetyka kliniczna
techniki pcr, IV rok, genetyka
Izolacja DNA plazmidy Genetyka Nieznany
Nowoczesne techniki cytogenetyczne, VI rok, Genetyka, Genetyka, Egzamin
Ćw 2 Izolacja DNA plazmidy Genetyka
KWASY NUKLEINOWE genetyka, Fizjoterapia i Rehabilitacja, Genetyka ćwiczenia
techniki pcr, IV rok, genetyka
BIOCHEMIA KWASOW NUKLEINOWYCH egzamin

więcej podobnych podstron