Izolacja i oznaczanie kwasów 

nukleinowych 

 
 
 
 
 
 

 

Kwasy nukleinowe 

polianiony związane z kationowymi białkami 

DNA 

- dwuniciowe 

-

związane z białkami 
(histony) 

- stabilne 

-

długie łańcuchy 
 

RNA 

- jednoniciowe, 

- grupa 2'OH, 

-

mało stabilne 

-

krótkie fragmenty 
 

Kwasy nukleinowe - lokalizacja 

Parametry mające wpływ na wydajność 

izolacji DNA/RNA 

• Poziom aktywności enzymów nukleotydo- i 

nukleozydolitycznych w eksplantach tkanek (najwięcej w 
śledzionie i trzustce, najmniej w grasicy) 
 

• Ilościowy stosunek RNA/DNA oraz zawartość DNA w 

materiale biologicznym (~4 dla wątroby szczura, ~0,4 w 
grasicy cielęcej) 
 

• Zawartość DNA (0,2% w wątrobie szczura, 2,5% w 

grasicy cielęcej   

Wymagania stawiane procedurze izolacji 

kwasów nukleinowych 

1. Zniszczenie membran i ściany komórkowej by uwolnić 

kwasy nukleinowe. 

 

2. Ochrona 

przed enzymamy trawiącymi (DNazami i 

RNazami). 

 

3. Oddzielenie 

kwasów nukleinowych od pozostałych 

składników komórki (białka, tłuszcze). 

Johann Friedrich Miescher 

 

 

W 1869 r. wyizolował z leukocytów ludzkich 
substancję, którą nazwał „nukleiną”. Zauważył, że zawiera  
fosfor i azot w stałych proporcjach. 
Opracował metodę oczyszczania nukleiny z tkanek. 
 
 

Metoda izolacji DNA/RNA wg. Schmidta i 

Thanhausera (1945r.) 

 

Materiał do izolacji  

Komórki bakteryjne i eukariotyczne 

 
• tkanki: 

– krew, 
– wycinki śródoperacyjne, 
– fragmenty roślin, 

• hodowle komórek zwierzęcych, roślinnych i bakterii 
• żywność, 
• z wydzielin i wydalin, 
• mikroślady (cebulki włosów, ślady śliny, wyczyszczone ślady 

krwi)  

• materiału kopalnego, 

Cele izolacji 

1. Analiza sekwencji 

– diagnostyka chorób 

-

wykrywanie mutacji 

-

badania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP, ang. single 
nucleotide polymorphism). 
 

2. 

Identyfikacja osób, oznaczanie ojcostwa 

 

-  analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych. 

 

3. Badania naukowe 
  

-  

ustalanie klasyfikacji organizmów, 

 

-  

tworzenie konstruktów genowych, 

 

-  klonowanie

. 

 
4. 

Żywność 

 

- 

tworzenie organizmów transgenicznych (poprawa produktywności, 

 

wartości odżywczej), 

 

- 

badanie zafałszowania żywności. 

 

5. Leczenie 

– terapie genowe. 

 

 

Izolowane kwasy nukleinowe 

• DNA genomowy – chlorowodorek guanidyny, kolumienki 

 

• DNA plazmidowy – liza alkaliczna, kolumienki  

 

• RNA całkowite – Trizol, Tri Reagent, kolumienki 

 

• mRNA – na zasadzie powinowactwa do ogonów poliA 

Skala izolacji plazmidowego DNA z 

hodowli bakteryjnych 

• Mini skala – 3-5 ml hodowli, do 20ug DNA 

 

• Midi skala – 100 ml hodowli, do 100ug DNA 

 

• Maxi skala - 250-500ml hodowli, do 0,5mg DNA 

 

• Mega skala – 0,5 – 2,5l hodowli, do 2,5mg DNA 

 

• Giga skala – 2,5l – 5l hodowli, aż do 10mg DNA  

 

Zasada wiązania DNA do złoża 

krzemionkowego 

 

Etapy izolacji DNA plazmidowego 

na małą skalę z hodowli bakteryjnej 

Hodowla 

bakteryjna 

Wirowanie 

5,5k G 

Zawieszenie 

bakterii w 

roztworze 

stabilizującym 

Liza 

alkaliczna 

„Neutralizacja” 

i wytrącenie 

białek 

Wirowanie 

12k G  

Dalsze 

odbiałczanie 

próby przez 

FCI 

Precypitacja 

DNA 

Odsolenie 70% alkoholem 

etylowym 

Zawieszenie w wodnym lub 
buforowanym roztworze 
RNazy (20ug/ml) 

FCI 

– fenol-chloroform-alkohol izoamylowy 25:24:1 

kolista zrelaksowana 

liniowa 

superskręcona 

Formy konformacyjne plazmidów 

forma liniowa  

(L 

– linear) 

forma kolista 

zrelaksowana 

(OC 

– open circular) 

forma kolista  superskręcona  

(CCC 

– closed circular 

coiled) 

Izolacja genomowego DNA 

• Liza termiczna, enzymatyczna   (proteinaza K),  

 

• Denaturacja 5M GuHCl – sól chaotropowa, 

 

• Precypitacja, odsalanie,  

 

• Trawienie RNA RNazą A, 

Precypitacja DNA 

• Alkohol etylowym 2,5:1 

 

• Alkoholem izopropylowym 1:1 

 

• Alkoholem butylowym 1:1  

 

Przy małych ilościach DNA stosuje się dodatek 
• Glikogenu 
• Octanu sodu pH 5,5 w stosunku 1:10 

Izolacja RNA 

 

metodą Chomczyńskiego 

• Liza komórek Trizolem, inkubacja i wirowanie 

 

• Dodanie chloroformu i separacja faz, RNA znajduje się w fazie 

wodnej  
 

• Precypitacja RNA izopropanolem  

 

• Odsalanie RNA etanolem 75% 

 

• Zawieszenie RNA w wodzie  
traktowanej DEPC lub buforze TE  

faza wodna 

interfaza (DNA, białka) 

faza organiczna (białka, lipidy) 

G.I.T. Laboratory Journal 05-06/2008, pp 9

–11, GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt 

Dla A

260

=1 

 

50

µg/mL dsDNA 

40

µg/mL ssDNA, RNA 

20

µg/mL ss oligo (krótkie 

fragmenty) 

Czysty preparat DNA: 

A

260

/A

280

= 1,8 ~2,0 

Spektrofotometryczne oznaczanie 

ilości kwasów nukleinowych 

Analiza kwasów nukleinowych 
oparta na zjawisku fluorescencji 

 

Pomiar fluorescencji fluorochromu: 

•DAPI 

•SYBR@Green 

•EtBr - bromek etydyny  

 

• interkalator 

• po wzbudzeniu UV emituje 

fluorescencję w świetle 
widzialnym 

• intensywność fluorescencji jest 

proporcjonalna do ilość DNA 

Efekt hiperchromowy 

•denaturacja DNA- zniszczenie wiazań 

niekowalencyjnych 

•wzrost absorbcji promieniowania UV 

•temperatura topnienia T

m

 

Barwne reakcje składników kwasów 

nukleinowych 

-

opierają się na reakcjach charakterystycznych składników kwasów 

nukleinowych uwalnianych w wyniku hydrolizy ( kwaśne pH, podwyższona 

temperatura) 

 

•Oznaczanie DNA oparte na reakcji deoksyrybozy z difenyloaminą w 

środowisku kwaśnym- niebieski produkt λ=600nm (próba Dishiego) 

 

•Oznaczanie RNA oparte na reakcji rybozy z orcynolem- zielony produkt 

λ=660nm  

Próba Dishiego 

Wykrywanie RNA metodą orcynową 

Dziękuję za uwagę 

 

W sali „VIII W” kolokwium piszą grupy 
• 2a 
• 2b 
• 3b 
• 4a