Izolacja i oznaczanie kwasów

nukleinowych

Kwasy nukleinowe

polianiony związane z kationowymi białkami

DNA

- dwuniciowe

-

związane z białkami
(histony)

- stabilne

-

długie łańcuchy

RNA

- jednoniciowe,

- grupa 2'OH,

-

mało stabilne

-

krótkie fragmenty

Kwasy nukleinowe - lokalizacja

Parametry mające wpływ na wydajność

izolacji DNA/RNA

• Poziom aktywności enzymów nukleotydo- i

nukleozydolitycznych w eksplantach tkanek (najwięcej w
śledzionie i trzustce, najmniej w grasicy)

• Ilościowy stosunek RNA/DNA oraz zawartość DNA w

materiale biologicznym (~4 dla wątroby szczura, ~0,4 w
grasicy cielęcej)

• Zawartość DNA (0,2% w wątrobie szczura, 2,5% w

grasicy cielęcej

Wymagania stawiane procedurze izolacji

kwasów nukleinowych

1. Zniszczenie membran i ściany komórkowej by uwolnić

kwasy nukleinowe.

2. Ochrona

przed enzymamy trawiącymi (DNazami i

RNazami).

3. Oddzielenie

kwasów nukleinowych od pozostałych

składników komórki (białka, tłuszcze).

Johann Friedrich Miescher

W 1869 r. wyizolował z leukocytów ludzkich
substancję, którą nazwał „nukleiną”. Zauważył, że zawiera
fosfor i azot w stałych proporcjach.
Opracował metodę oczyszczania nukleiny z tkanek.

Metoda izolacji DNA/RNA wg. Schmidta i

Thanhausera (1945r.)

Materiał do izolacji

Komórki bakteryjne i eukariotyczne

• tkanki:

– krew,
– wycinki śródoperacyjne,
– fragmenty roślin,

• hodowle komórek zwierzęcych, roślinnych i bakterii
• żywność,
• z wydzielin i wydalin,
• mikroślady (cebulki włosów, ślady śliny, wyczyszczone ślady

krwi)

• materiału kopalnego,

Cele izolacji

1. Analiza sekwencji

– diagnostyka chorób

-

wykrywanie mutacji

-

badania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP, ang. single
nucleotide polymorphism).

2.

Identyfikacja osób, oznaczanie ojcostwa

- analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych.

3. Badania naukowe

-

ustalanie klasyfikacji organizmów,

-

tworzenie konstruktów genowych,

- klonowanie

.

4.

Żywność

-

tworzenie organizmów transgenicznych (poprawa produktywności,

wartości odżywczej),

-

badanie zafałszowania żywności.

5. Leczenie

– terapie genowe.

Izolowane kwasy nukleinowe

• DNA genomowy – chlorowodorek guanidyny, kolumienki

• DNA plazmidowy – liza alkaliczna, kolumienki

• RNA całkowite – Trizol, Tri Reagent, kolumienki

• mRNA – na zasadzie powinowactwa do ogonów poliA

Skala izolacji plazmidowego DNA z

hodowli bakteryjnych

• Mini skala – 3-5 ml hodowli, do 20ug DNA

• Midi skala – 100 ml hodowli, do 100ug DNA

• Maxi skala - 250-500ml hodowli, do 0,5mg DNA

• Mega skala – 0,5 – 2,5l hodowli, do 2,5mg DNA

• Giga skala – 2,5l – 5l hodowli, aż do 10mg DNA

Zasada wiązania DNA do złoża

krzemionkowego

Etapy izolacji DNA plazmidowego

na małą skalę z hodowli bakteryjnej

Hodowla

bakteryjna

Wirowanie

5,5k G

Zawieszenie

bakterii w

roztworze

stabilizującym

Liza

alkaliczna

„Neutralizacja”

i wytrącenie

białek

Wirowanie

12k G

Dalsze

odbiałczanie

próby przez

FCI

Precypitacja

DNA

Odsolenie 70% alkoholem

etylowym

Zawieszenie w wodnym lub
buforowanym roztworze
RNazy (20ug/ml)

FCI

– fenol-chloroform-alkohol izoamylowy 25:24:1

kolista zrelaksowana

liniowa

superskręcona

Formy konformacyjne plazmidów

forma liniowa

(L

– linear)

forma kolista

zrelaksowana

(OC

– open circular)

forma kolista superskręcona

(CCC

– closed circular

coiled)

Izolacja genomowego DNA

• Liza termiczna, enzymatyczna (proteinaza K),

• Denaturacja 5M GuHCl – sól chaotropowa,

• Precypitacja, odsalanie,

• Trawienie RNA RNazą A,

Precypitacja DNA

• Alkohol etylowym 2,5:1

• Alkoholem izopropylowym 1:1

• Alkoholem butylowym 1:1

Przy małych ilościach DNA stosuje się dodatek
• Glikogenu
• Octanu sodu pH 5,5 w stosunku 1:10

Izolacja RNA

metodą Chomczyńskiego

• Liza komórek Trizolem, inkubacja i wirowanie

• Dodanie chloroformu i separacja faz, RNA znajduje się w fazie

wodnej

• Precypitacja RNA izopropanolem

• Odsalanie RNA etanolem 75%

• Zawieszenie RNA w wodzie
traktowanej DEPC lub buforze TE

faza wodna

interfaza (DNA, białka)

faza organiczna (białka, lipidy)

G.I.T. Laboratory Journal 05-06/2008, pp 9

–11, GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt

Dla A

260

=1

50

µg/mL dsDNA

40

µg/mL ssDNA, RNA

20

µg/mL ss oligo (krótkie

fragmenty)

Czysty preparat DNA:

A

260

/A

280

= 1,8 ~2,0

Spektrofotometryczne oznaczanie

ilości kwasów nukleinowych

Analiza kwasów nukleinowych
oparta na zjawisku fluorescencji

Pomiar fluorescencji fluorochromu:

•DAPI

•SYBR@Green

•EtBr - bromek etydyny

• interkalator

• po wzbudzeniu UV emituje

fluorescencję w świetle
widzialnym

• intensywność fluorescencji jest

proporcjonalna do ilość DNA

Efekt hiperchromowy

•denaturacja DNA- zniszczenie wiazań

niekowalencyjnych

•wzrost absorbcji promieniowania UV

•temperatura topnienia T

m

Barwne reakcje składników kwasów

nukleinowych

-

opierają się na reakcjach charakterystycznych składników kwasów

nukleinowych uwalnianych w wyniku hydrolizy ( kwaśne pH, podwyższona

temperatura)

•Oznaczanie DNA oparte na reakcji deoksyrybozy z difenyloaminą w

środowisku kwaśnym- niebieski produkt λ=600nm (próba Dishiego)

•Oznaczanie RNA oparte na reakcji rybozy z orcynolem- zielony produkt

λ=660nm

Próba Dishiego

Wykrywanie RNA metodą orcynową

Dziękuję za uwagę

W sali „VIII W” kolokwium piszą grupy
• 2a
• 2b
• 3b
• 4a