Techniki izolacji kwasów nukleinowych
Podstawowe zasady
Pierwszym etapem jest liza komórek w celu preparacji jądra komórkowego. Następnie błona jądrowa ulega dezintegracji, po to, aby kwasy nukleinowe przeszły do roztworu wodnego. Do tych etapów stosujemy jonowe detergenty, tj. sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS).
W celu uzyskania czystego preparatu kwasów nukleinowych, należy oddzielić związane z nimi białka. Przeprowadzamy to za pomocą ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi, np. fenol. Aby nie uszkodzić DNA przeprowadzamy kilkuetapową ekstrakcję z różnymi rozpuszczalnikami: fenol, chloroform, alkohol izoamylowy.
Elektroforeza
Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.
Wyróżniamy trzy rodzaje:
Kapilarna;
Żelowa;
Bibułowa (nie używana).
Do wyizolowania kwasów nukleinowych stosuje się min:
Chloroform
Alkohol izoamylowy
Złoża krzemionkowe
Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych następuje poprzez ekstrakcję fenolem i chloroformem.
Lipidy usuwamy dzięki ekstrakcji chloroformem. Ekstrakcję chloroformem wykonujemy przeważnie bezpośrednio po ekstrakcji fenolem, gdyż chloroform oprócz lipidów i białek usuwa z fazy wodnej również resztki fenolu. Chloroform powoduje również powierzchniową denaturację białek.
Alkohol izoamylowy redukuje pienienie i stabilizuje granicę fazową, gdzie koncentruje się białko. Usuwa ze środowiska uszkodzone DNA.
W celu ułatwienia prac związanych z badaniem kwasów nukleinowych, firmy biotechnologiczne sprzedają specjalne kolumny do izolacji i oczyszczania DNA i RNA. Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Uzyskany zastosowaniem membran i żywic krzemionkowych DNA, charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości i może być wykorzystany do analizy restrykcyjnej, sekwencjonowania, ligacji… itp.
Membrany krzemionkowe są umieszczone w pojedynczych naczyniach (skala mikro), w postaci 96-dołkowej oraz w kolumnach (skala midi i maxi). Procedura wykorzystująca membranę silikonową opiera się na zasadzie związania i wymycia. DNA wiąże się do membrany w obecności soli chaotropowych, natomiast wszystkie zanieczyszczenia (polisacharydy, barwniki i in.) pozostają niezwiązane.
Żywica jonowymienna JETSTAR została wynaleziona i opatentowana przez GENOMED. Służy ona do uzyskiwania ultra czystego kosmidowego i plazmidowego DNA, wolnego od endotoksyn. DNA oczyszczone przez JETSTAR może być wykorzystywane do transfekcji, mikroiniekcji, sekwencjonowania fluorescencyjnego.