Nowoczesne techniki cytogenetyczne
Anna Latos-Bieleńska
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu
Metody cytogenetyki klasycznej
Zalety
Duża dostępnośc badania (badanie szeroko stosowane we wszystkich ośrodkach genetyki medycznej
Stosunkowo niski koszt badania
Wady
Ograniczona rozdzielczośc badania (5-10 Mb w zależności od jakości preparatów cytogenetycznych)
Wiarygodnośc badania zależy od doświadczenia cytogenetyka
Badanie możliwe tylko na komórkach dzielących się
Oczekiwanie na wynik od 5 dni do 3 tygodni
FISH - nowoczesna technika badania kariotypu podnosząca jakość diagnostyki cytogenetycznej
Zalety:
Technika uzupełniająca metody cytogenetyki klasycznej poprzez identyfikację addycji, insercji oraz chromosomów markerowych.
Dzięki dużej rozdzielczości (< 3 Mpz, nawet do 0,5 kbz) umożliwia wykrycie submikroskopowych aberracji chromosomowych. Metoda z wyboru w diagnostyce mikrodelecji
Umożliwia szybką analizę setek komórek (ważne w przypadku kariotypów mozaikowych)
Umożliwia badanie aberracji chromosomowych w komórkach nie dzielących się
Pozwala na szybkie uzyskanie wyniku ( do 24 godz.)
Umożliwia badanie materiału archiwalnego (kostki parafinowe)
Pozwala na badanie pojedynczej komórki (ważne w diagnostyce genetycznej preimplantacyjnej!)
Wady:
Nie pozwala na analizę całego kariotypu
Wysoki koszt odczynników, zwłaszcza sond molekularnych
Zasada FISH
Odpowiednio dobrana sonda molekularna (fragment DNA) wyznakowana fluorochromem nałożona na preparat (chromosomy lub jądra komórkowe na szkiełku podstawowym) wiąże się z DNA materiału biologicznego w preparacie i w tym miejscu obserwujemy pod mikroskopem fluorescencję.
Sondy molekularne w FISH
Specyficzne - komplementarne do określonego regionu chromosomu
Centromerowe - komplementarne do centromerów
Malujące - pokrywające cały chromosom lub poszczególne jego ramiona
Sonda malująca sonda centromerowa
FISH - widoczna translokacja insercyjna FISH do jądra interfazowego - triploidia
SKY-FISH - analiza widmowa kariotypu
Stosuje się jednocześnie 24 sondy molekularne (dla każdej pary chromosomów autosomalnych oraz dla X i Y inna) wyznakowane różnymi kombinacjami 5 różnych fluorochromów.
Komputerowa analiza widmowa obrazu po hybrydyzacji - ocena całego kariotypu w jednym badaniu.
CGH - Porównawcza hybrydyzacja genomowa
Potrzebne:
Preparat cytogenetyczny (chromosomy osoby o prawidłowym kariotypie)
DNA osoby badanej wyznakowany jednym fluorochromem (np. fluorescencja zielona)
DNA kontrolny - prawidłowy DNA wyznakowany innym fluorochromem (np.fluorescencja czerwona)
Cot1 DNA do wysycenia regionów zawierających sekwencje wysoko powtarzające się
Zasada metody:
Na preparat cytogenetyczny nakłada się DNA pacjenta i DNA kontrolny (1:1) i prowadzi hybrydyzację. Po hybrydyzacji analiza komputerowa obrazu. Interpretacja wyników:
Przewaga fluorescencji zielonej - duplikacja materiału genetycznego pacjenta
Przewaga fluorescencji czerwonej - delecja materiału genetycznego pacjenta
Zalety
Umożliwia badanie całego genomu (wszystkich chromosomów)
Nie wymaga hodowli komórek pacjenta
Można wykorzystac materiał archiwalny (kostki parafinowe)
Można zrobi badanie na podstawie pojedynczej komórki
Wady CGH
Nie wykrywa aberracji zrównoważonych
Nie wykrywa triploidii
Wysoki koszt badania
Array CGH
Zasada techniki taka sama jak dla CGH (tzn. DNA kontrolny i DNA badany wyznakowane różnymi fluorochromami), ale sekwencja docelowa to małe odcinki DNA umieszczone na nośniku (mikromacierz). Olbrzymia rozdzielczośc badania. Obecnie jeszcze koszt badania bardzo wysoki, ale jest to technologia przyszłości.
1