TERAPIA GENOWA
- leczenie przyczyn, a nie objawów
- wprowadzanie genu terapeutycznego lub oligonukloetydu
gen terapeutyczny ---> wirusowy DNA ---> w kompleksie lub nagi DNA
---> plazmidowy DNA ---> zrekombinowany DNA
TRANSFER
komórka docelowa
EKSPRESJA
efekt fenotypowy
Rodzaje terapii:
- germinalna: eliminacja defektu genetycznego w komórkach rozrodczych lub we wczesnym okresie zarodkowym (zakazana ze wzgl. moralnych)
- somatyczna: pierwotny efekt nie jest usuwany, lecz ma charakter zachowawczy
Za pomocą terapii można:
- uzyskać przywrócenie lub wzmocnienie utraconej w pełni lub częściowo funkcji zmutowanego genu
- uzyskać supresję działania takiego genu, którego produkt zmieniony w wyniku mutacji jest odpowiedzialny za wystąpienie choroby
Przywrócenie utraconej funkcji genu polega na uzyskaniu ekspresji wprowadzanego „funkcjonalnego” genu w ściśle określonej tkance.
Gen funkcjonalny = gen pozbawiony intronów (same eksony), jest to cDNA
Efekt celowania można osiągnąć:
- zaopatrująć wprowadzany gen w odpowiedni system regulacji
- wprowadzając prawidłowy gen bezpośr. do tkanki, w której ma ulec ekspresji
Wprowadzanie genu
Gen musi się utrzymać w komórce jak najdłużej (bo czas ekspresji zależy od długości życia komórki), przy czym stopień ekspresji zależy od ilości produkowanewgo białka (kodowanego przez ten gen funkcjonalny)
Terapeutyczny gen, uzyskiwany efekt:
>> kompensacja defektu genetycznego
>> eliminacja „złych” komórek
>> nowe cechy fenotypowe
>> hamowanie ekspresji zmutowanego genu
Terapię genową zastosowano po raz pierwszy 14.09.1990 o 8:59, była to kompensacja niedoboru ADA
Kompensacja defektu genetycznego
- metodę stosuje się najczęściej w mutacjach recesywnych
- nie usuwa się defektu, lecz kompensuje jego skutki biologiczne
- np. geny kodujące globiny, czynniki krzepnięcia, deaminazę adenozynową
Ograniczenia:
1. wielkość genu (do kilka tys. par zasad)
2. wydajność transferu genu do komórek docelowych- konieczne jest zainfekowanie jak największej ilości komórek
3. przypadkowa losowa integracja transgenu z genomem komórki- mutacje insercyjne
4. czas utrzymywania się transgenu w kom.docelowych
5. wektory- najlepiej wysokowydajne, łatwe w stosowaniu i bezpieczne
ETAPY STRATEGII:
1. przygotowanie geny (wycięcie intronów)
2. przygotowanie wektora
3. wybór i przygotowanie kom.docelowych
Sposoby wprowadzania transgenu:
1. in vivo
np. domięśniowo, doguzowo, dożylnie, czyli bezpośr. do organizmu
wykorzystuje się tu swoistość transdukcyjną, tj.:
- naturalny tropizm wirusów do konkretnych tkanek (np. neurotropizm wirusa opryszczki)
- za pomocą nośników z odpowiednimi ligandami, które rozpoznają swoiste receptory (np. ligand asjaloorozomukoidu --> hepatocyty)
2. ex vivo
- pobranie komórek od pacjenta
- hodowla i modyfikacja genetyczna
- wprowadzenie z powrotem do organizmu pacjenta
ważne jest, żeby transgeny wprowadzać do określonych komórek, z pominięciem komórek rozrodczych
Wybór komórek docelowych zależy od typu schorzenia (np. nabłonek oddechowy w mukowiscydozie). Nie zawsze trzeba wprowadzać transgen do „chorej” tkanki (np. w hemofilii transgen jest wprowadzany do mięśni. Mięśnie zaczynają produkować czynnik krzepnięcia i uwalniają go do krwioobiegu).
Hamowanie ekspresji zmutowanego genu
- w mutacjach dominujących
- ekspresję genu hamuje się na poziomie transkrypcji lub translacji, za pomocą antysensów
ANTYSENSY = oligonukleotydy (20-30 par zasad, deoksyrybo- lub rybonukleotydy), których sekwencja jest komplementarna do mRNA lub do sekwencji DNA genomu lub jego promotora.
Antysensy hybrydyzując z:
- mRNA tworzą duplexy; duplex uniemożliwia połączenie się mRNA z rybosomem
- promotorem uniemożliwiają replikację
- DNA tworzą triplexy; do triplexów nie mogą przyłączyć się czynniki transkrypcji, uniemożliwiając transkrypcję
Skuteczność terapii antysensami zależy od:
>> stabilności antysensów
>> ich ilości w komórce
>> metod wprowadzenia antysensów do komórki
Korekta zmutowanego genu
- zarówno choroby dominujące, jak i recesywne
- korekta jest trwałą, a wielkość genu nie ma znaczenia
Do naprawy wykorzystuje się oligonukleotydy, rybozymy i oligonukleotydy chimeryczne (tj. zbudowane z deoksyrybo- i rybonukleotydów na raz).
Udział w procesie biorą:
- enzymy naprawiające błędne sparowania
- enzymy wycinające nukleotydy
- enzymy biorące udział w homologicznej rekombinacji
Ograniczenia:
- brak precyzji
- powstawanie dodatkowych mutacji
- niska wydajność procesu
Eliminacja „złych” komórek
- zastosowanie w nowotworach i HIV
Zabijanie komórek nowotworowych:
1. bezpośr.: gen kodujący toxyczne białko jest wprowadzany do komórki nowotworowej i ulega ekspresji (tylko tam!), zabijając komórkę
>> geny samobójcze: kodują białka, które przekształcają podawany i.v. prolek do tox. metabolitów, zabijających komórkę
>> geny proapoptyczne: indukują apoptozę
2. pośr.: uaktywanienie komórek immunologicznych do swoistego zabijania komórek nowotworowych
Modyfikacja genetyczna komórek -> nadawanie nowych cech fenotypowych
>> geny kodujące białka aktywujące komórki ukł.immuno. (geny immunomodulacyjne)
>> geny kodujące czynniki proangiogenne (do terapeutycznej angiogenezy w chorobach niedokrwiennych)
>> geny kodujące czynniki antyangiogenne (np. angiostatyna, do terapii nowotworów)
>> geny wielolekowej oporności MDR (transfer do szpiku pozwala osłonić komórki prawidłowe przed działaniem cytostatyków, stosowanych w nowotworach)
>> szczepionki DNA (wprowadza się in vivo wektora kodującego antygen i wywołuje oporność)
>> szczepionki RNA (wprowadza się samoreplikujące się wirusy RNA, które zawierają geny kodujące antygeny )
PODSUMOWANIE STRATEGII
Nowotwory:
- zmiana „złośliwego” fenotypu
- protekcja komórek prawidłowych
- eliminacja komórek nowotworowych
- hamowanie ekspresji zmutowanych genów
Choroby monogenowe AD:
- hamowanie ekspresji zmutowanych genów
Choroby monogenowe AR:
- kompensacja defektu
- korekcja mutacji
HIV:
- eliminacja zainfekowanych komórek
- hamowanie ekspresji genów wirusowych
SŁOWNICZEK ;p
Wektor = nośnik, do którego można wstawić DNA
Wektor ekspresyjny = wektor umożliwiający wydajną transkrypcję wbudowanego do niego transgenu
Wektory niewirusowe = kompleksy (liposomy kationowe lub związki polikationowe + palzmidowy DNA)
Transdukcja = do transferu użyto wektora wirusowego
Transfekcja = do transferu użyto wektora niewirusowego
Najczęściej używane wirusy:
- adenowirusy
- etrowirusy
- entiwirusy
- herpes
- AAV (wirusy towarzyszące adenowirusom)