56. Aplikace genetiky
Genetika mikroorganismů
1) Genetika virů
U virů může docházet k tzv. rekombinacím mezi molekulami jejich nukleových kyselin. Může se tak dít v případě, že je hostitelská buňka tzv. superinfikována - jsou v ní najednou dva geneticky odlišné viry se shodnou hostitelskou specifitou a pomnožují se ve stejný okamžik. Viriony, které pak takovouto pozměněnou nukleovou kyselinu obsahují mohou mít jiné vlastnosti. Také při replikaci virové DNA v hostitelské buňce dochází často k záměnám nukleotidů v řetězci. Dochází tak k virovým mutacím.
2) Genetika bakterií
U bakterií je možná rekombinace jejich genetických vlastností i přes jejich nepohlavní způsob rozmnožování. Tato rekombinace se označuje jako parasexuální rekombinace, i když nemá se sexualitou nic společného. Nejdůležitějším způsobem je bakteriální konjugace k rekombinacím mezi molekulami DNA dvou různých bakteriálních buněk dochází především při bakteriální konjugaci. Její podstatou je kontakt buněčných stěn bakterií a přenos molekuly DNA z donorové buňky do recipientní pomocí plazmidu. V recipientní buňce poté může dojít k přenosu rekombinace, tento jev je podobný procesu crossing-over u eukaryotických organismů. Tento přenos informace mezi dvěma buňkami je ovšem vždy jen jednosměrný. Navíc musí mít donorové buňky v cytoplazmě specifický plazmid (tzv. F-plazmid), narozdíl od recipientní buňky, která tento plazmid nikdy nemá.
Dědičnost člověka
U člověka jako u nejsložitějšího organismu se vyvinula také nejsložitější dědičnost. V jádře každé diploidní buňky se ukrývají dvě sady po 23 chromozomech a v každé chromozomové sadě 39 000 genových lokusů. Průměrná délka každého lokusu je asi 27 000 párů bází.
Proto je složité analyzovat lidský genom, ještě k tomu nelze z etických důvodů pokusně křížit a navíc je jeho generační doba mimořádně dlouhá. Proto se musí používat jiné metody studia lidské dědičnosti, místo experimentálních jen pozorovací metody:
výzkum molekulárně genetický - spočívá v izolaci DNA z buněčných jader lymfocytů člověka. takto izolovanou DNA lze pak zkoumat mnoha způsoby. Dnešní výzkum lidského genomu se neustále zrychluje a soustřeďuje se hlavně na výzkum genů, jejichž mutace způsobují vážné genetické choroby. To lze pomocí tzv. genetických sond, což jsou dostupné řetězce DNA příslušného mutovaného genu. Zkoumá se, jestli daná oblast genu s příslušnou genovou sondou hybridizuje či nikoliv. Pokud ano, je genová mutace přítomna i ve zkoumaném úseku DNA. Lze takto odhalovat i zdravé přenašeče těchto chorob. Tato metoda se nazývá mutační analýza (přímá DNA diagnostika.). Ještě existuje tzv. segregační analýza genomu (nepřímá DNA diagnostika), což je odhalování ohrožených jedinců v rodině s výskytem určitého dědičného onemocnění.
výzkum cytogenetický - jedná se o vyšetření karyotypu člověka pomocí metody proužkování chromozomů. Tyto chromozomy se poté srovnají se standardním obrazem lidských metafázových chromozomů, s tzv. idiogramem.
vyšetřování lidských fenotypů - studium lidských fenotypových znaků se neustále rozšiřuje. Základem jsou somatoskopická pozorování a somatometrická měření, vyšetření typologická, funkční, cytologická, imunologická a biochemická
výzkum rodokmenů - tzv. rodopis (genealogie) je nejběžnějším metodickým postupem genetiky člověka. Je to v podstatě analýza rodového výskytu určitého znaku. Výsledky se vyjadřují graficky tzv. genealogickými schématy. Stupeň příbuznosti se vyjadřuje koeficientem příbuznosti (r), ten udává pravděpodobný podíl alel pro obě příbuzné osoby společných. Pro jednovaječná dvojčata je r = 1, pro sourozence r = 0,5 atd.
výzkum dvojčat - u člověka mohou vzniknout dva typy dvojčat. Jsou to jednovaječná a dvouvaječná dvojčata. Dvojčata dvouvaječná (dizygotní) vznikají oplozením dvou současně dozrálých vajíček. Dvojvaječná (monozygotní) vznikají rozdělením vajíčka v první rýhovací fázi, dále se vyvíjí dvě blastomery zcela odděleně (jen asi ve 4% případů vznikají jednovaječná dvojčata až rozdělením zárodečného terčíku). Dvouvaječná dvojčata jsou třikrát až čtyřikrát častější než jednovaječná. Přitom frekvence výskytu jednovaječných je stálá (asi 0,3%), frekvence dvouvaječných se zvyšuje s věkem matky. Z genetického hlediska jsou dvouvaječná dvojčata v podstatě dva stejně staří potomci s koeficientem příbuznosti 0,5. Oproti tomu jsou dvojčata jednovaječná vždy téhož pohlaví s koeficientem příbuznosti 1,0. Proto se označují jako identická dvojčata. Dvojčata přinášejí možnosti zjišťování dědivosti (heritability) lidských znaků. Dědivost je podíl dědičnosti na fenotypovém vyjádření znaku. Zjišťují se tak znaky podmíněné teoreticky pouze prostředím a znaky podmíněné pouze genotypově.
výzkum populací - pro genetické potřeby se bere populace člověka jako panmiktická populace. Lze použít Hardyho-Weinbergova zákona. Většinou se však musí aplikovat určité korekční faktory, neboť neomezená panmixie v podstatě u člověka neexistuje. Běžné je nenáhodné párování. Panmixii nejvíce porušují příbuzenské sňatky, které jsou poměrně časté v arabských zemích a v Indii. Zvyšuje se tím podíl homozygotů.
Genové inženýrství a biotechnologie
Genové inženýrství se zabývá přípravou umělých kombinací genů nebo vytvářením pozměněných či nových genů a jejich zavádění do genomu organizmů. Cílem je rekonstruovat (upravit či doplnit) jejich genetickou výbavu. Metodickým základem jsou manipulace s DNA in vitro (ve zkumavce) založené na přípravě rekombinantních molekul DNA a jejich klonování.
Klonování DNA
Klonováním DNA (klonováním genů, molekulárním klonováním) myslíme tvorbu klonů DNA. Klon DNA je soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA, které mohou být připraveny např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo tzv. polymerázovou řetězovou reakcí PCR (in vitro). Je to v podstatě enzym, který umožňuje namnožení úseku DNA i z jejího nepatrného množství (z jediné molekuly). Rekombinantní molekula DNA je molekula DNA vytvořená in vitro spojením cizorodé DNA s tzv. klonovacím vektorem. Klonovací vektor (přenašeč) je molekula DNA, která má schopnost přijmout cizorodou DNA, spojit se s ní a replikovat se v hostitelské buňce. Cizorodá či klonovaná DNA je úsek DNA vložený do klonovacího vektoru. Klonování DNA patří ke stěžejním metodám molekulární biologie. Umožňuje totiž z komplexního genomu izolovat jednotlivé dílčí úseky (např. jednotlivé geny).
Využití klonování DNA:
izolace genů, studium jejich struktury a funkce
studium regulačních oblastí, které řídí expresi genů
fyzikální a genetická analýza genomů
exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích a získávání jejich produktů ve velkém množství
Cílem je příprava látek využitelných v průmyslu (enzymy), zdravotnictví a farmacii (hormony, krevní faktory, vakcíny)
Klonování DNA zahrnuje tři základní kroky:
Přípravu rekombinantní molekuly DNA
Přenos této molekuly do vhodné hostitelské buňky a její pomnožení
Selekci klonů buněk obsahujících požadované molekuly rekombinantní DNA
DNA určená ke klonování je nejčastěji genomového původu z dárcovského organismu nebo se jedná o cDNA připravenou reverzní transkripcí z mRNA a nebo o DNA připravenou uměle chemickou syntézou. Genomová DNA se nejdříve štěpí na kratší úseky pomocí tzv. restrikčních endonukleáz, což jsou specifické endonukleázy (enzymy) produkované bakteriemi a umí štěpit DNA ve specifických místech, tzv. restrikčních místech. Odštěpí se tzv. restrikční fragmenty.
Pro zavedení cizorodé DNA do hostitelských buněk a pro jejich následné pomnožení se jako vektory používají molekuly DNA odvozené z bakteriálních či kvasinkových plazmidů nebo z virů. Spojení vektorové a cizorodé DNA zabezpečuje DNA-ligáza. Vzniká tak rekombinantní molekula DNA. Přenos takovýchto molekul do hostitelského organizmu se provádí nejčastěji pomocí tzv. transformace, tedy volného vniknutí do buňky z volného prostředí. Jinou metodou je elektroporace, při ní se díky krátkému elektrickému impulzu o vysokém napětí vytvoří v membráně buňky póry a těmi DNA proniká. Třetí možností je přenos pomocí viru, toto probíhá přirozenou cestou.
Příprava transgenních organismů
Gen upravený metodami genového inženýrství a přenášený do nového hostitelského organismu se označuje jako transgen. Hostitelský organismus se poté nazývá transgenní nebo také geneticky modifikovaný organismus (GMO).
Hlavní cíle:
zvýšit výnosy a nutriční hodnotu zemědělských plodin, produkci hospodářských zvířat, drůbeže a ryb a omezit chemizaci v zemědělské výrobě
zlepšit chuť, kvalitu a trvanlivost potravin, modifikací rostlin získat nové suroviny pro chemickou výrobu
připravit enzymy s novými vlastnostmi a nové typy léčiv a biopreparátů, vyznačující se vyšší účinností bez nežádoucích účinků
využít mikroorganismy pro ekologické čištění vody a půdy
připravit transgenní rostliny a zvířata produkující farmakologicky aktivní látky
Genetické poradenství, eugenika
Společnost má jistě zájem na tom, aby se nerodili dědičně postižení jedinci. Na tom je založena eugenika, soubor vědecky fundovaných opatření směřujících ke zvyšování kvality lidstva. Genetika dnes umožňuje vyhledávat jedince nesoucí patogenně působící alely ve svých genotypech a předcházet tak narození jejich postižených potomků. Ve všech vyspělých zemích proto funguje síť specializovaných zařízení klinické genetiky, které vyhledávají nositele mutací.
Genetické poradenství stanovuje v konkrétních případech genetickou prognózu a seznamuje s ní své klienty, kteří pak mají možnost se sami rozhodnout, zda chtějí přivést na svět dítě s daným rizikem. Vyvíjí se také preventivní vyhledávací (skríningové) programy, které jsou dvojího typu:
celoplošný skríning - vztahuje se na každou těhotnou ženu
skríning cílený - vztahuje se na rizikové skupiny rodičů (vyšší věk, genetická zátěž v rodu, rizikové povolání na mutace atd.)
Prenatální diagnostika
amniocentéza - odběr plodové vody, získává se nabodnutím amniového obalu zárodku skrz břišní stěnu za kontroly ultrazvukem. Obsahuje buňky plodu, které lze využít např. k cytogenetickému vyšetření.
Fingerprinting DNA („otisky prstů“)
Charakteristický vzorec, který vzniká rozštěpením DNA určitými restrikčními endonukleázami a je patrný při následné elektroforéze (ELFO = metoda rozdělující látky v el. poli podle jejich velikosti a náboje). Je specifický pro každého člověka, slouží k jisté identifikaci osob (v kriminalistice)
1