Pcr
Metoda PCR polega na amplifikacji genu In vitro wykorzystując reakcje łańcuchowej polimerazy Polimerase Chain Reaction. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana do amplifikacji bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie, ale pod warunkiem że znana jest sekwencja otaczająca powielany fragment. Zaletą PCR jest możliwość wykorzystania do reakcji DNA w znacznym stopniu zdegradowanego.
Etapy PCR
DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze 92-94 stopni Celcjusza. Mieszanina reakcyjna zawiera:
1.matryce DNA lub RNA
2. d NTP służące jako substraty reakcji dla polimerazy i dostarczające energii do jej przebiegu
3. termostabilną polimerazę
4. bufor
5. syntetyczne oligonukleotydy-startery o długości około 20 nukleotydów komplementarne do 3' końców obydwu nici DNA
Startery przyłączają się do komplementarnego odcinka DNA wyznaczając fragment, który ma być powielany. Startery są dodawane w dużym nadmiarze molowym w stosunku do denaturowanego DNA. Następnie obniża się temperaturę do 40-60 stopni Celcjusza, co powoduje łączenie się primerów (hybrydyzację) z komplementarnymi odcinakami DNA(matrycą). Służą one jako startery dla termo stabilnej polimerazy DNA, np. Taq (polimeraza izolowana z bakterii Thermus aquaticus). Temperatura przyłączania starterów jest uzależniona od rodzaju zasad wchodzących w ich skład. Niższe temperatury renaturacji( anilingu, hybrydyzacji) mogą powodować niespecyficzne łączenie się matrycy ze starterem. Synteza nowej nici(elongacja) odbywa się w temperaturze 72 stopni. Następnie mieszanina jest podgrzewana aby nowo powstałe dwuniciowe fragmenty uległy dysocjacji. Potem znów obniża się temperaturę i cały cykl się powtarza.
Warianty PCR
Najważniejszym zastosowaniem PCR jest uzyskanie zwiększonej ilości DNA, w którym występuje mutacja lub polimorfizm, a następnie jego dalsza analiza z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych(PCR-RFLP) lub technik elektroforetycznych (PCR-HD, PCR-SSCP).
Do wykrywania znanych mutacji służą enzymy restrykcyjne. Trawiąc badany produkt reakcji PCR enzymem restrykcyjnym, można wykryć zmianę, polegającą na pojawieniu się lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez dany enzym restrykcyjny co ujawnia się jako jego brak lub dodatkowy prążek w elektroforezie.
Przykłady:
RG-PCR i ACRS-PCR polegają na wprowadzeniu do powielanego materiału takiej zmiany nukleotydów, aby łącznie ze zmianą powstałą w wyniku mutacji utworzyło się miejsce charakterystyczne dla danego enzymu restrykcyjnego
ARMS-PCR i ASA-PCR pozwalają rozróżniać allele badanego fragmentu.
RT-PCR technika połączona z odwrotną transkrypcją. Pozwala na analizę ekspresji genów oraz wykrywanie patogenów, których materiałem jest RNA. Dla wykrycia mutacji analiza tran skryptów ograniczona jest do tkanki, w której dany gen ulega ekspresji.
PCR-mulipleks- pozwala przeprowadzić amplifikację kilku regionów jednego lub kilku genów. Jest to możliwe przy zastosowaniu kilku par starterów.
PCR-HD umożliwia wykrywanie hetero dupleksów DNA:DNA miedzy DNA zmutowanym a DNA typu dzikiego.
PCR-SSCP- analiza polimorfizmu jednoniciowych fragmentów DNA umożliwia wykrycie nieznanych mutacji.
PCR-RFLP -polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych powstałe w wyniku zmian w pojedynczej zasadzie(np. niedokrwistość sierpowata) albo delecji lub insercji DNA w obrębie fragmentu restrykcyjnego( np. talasemie) są użytecznym narzędziem diagnostycznym. Polimorfizmy RFLP są dziedziczne i segregują się według wzoru Mendla. Polimorfizm RFLP jest używany głównie w celu określenia chorób dziedzicznych , w których nie znamy ubytku funkcji. Stosując technikę RFLP znaleziono gen dystrofii mięśniowej typu Duchenne sprzężony z chromosomem X, podobnie wadę w pląsawicy Huntingtona umiejscowiono w końcowym regionie ramienia krótkiego chromosomu 4, a wada wywołująca torbielowatość nerek jest sprzeżona z locus alpha globiny w chromosomie 16.
Ponadto metody PCR znalazły zastosowanie w wykrywaniu:
Patogenów infekcyjnych
Zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych, predyspozycjach do chorób nowotworowych, wykrywaniu nowotworów.
Polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej- ustalanie ojcostwa
Badanie pochodzenia śladów biologicznych-kryminalistyka
Ustalanie zgodności tkankowej.