BIOKATALIZA

Biokatalizator- podstawowe narzędzie procesu biotechnologicznego.

Najobszerniejsza klasa naturalnych substancji katalitycznych to enzymy.

CECHY ENZYMÓW:

1. Selektywność enzymów:

• selektywność substratowa

• stereoselektywność

• regioselektywność

• chemiselektywność

S E L E K T Y W N O Ś Ć S U B S T R A T O W A

Zdolność do tolerancji dużej grupy substratów (ale enzym katalizuje tylko określony typ reakcji).

Substraty transaminazy:

• 2-ketoglutaran

• β-fluorofenylopirogronian

• 4-tiometylo-2-ketomaślan

• fenylopirogronian

• indylopirogronian

• 3-imidazolopirogronian

Im bardziej skomplikowany enzym tym mniej substratów toleruje.

S T E R E O S E L E K T Y W N O Ś Ć (enancjoselektywność, diastereoselektywność)

Zdolność do odróżniania pojedynczych enencjomerów lub diastereoizomerów.

A. Produkcja herbicydów pochodnych kwasu fenoksypropionowego:

Substratem R-dehydrogenazy jest izomer R.

B. Produkcja aspartamu:

40.00 ton L-Asp / rok

Biosynteza aspartamu- enzym w postaci enzymatycznej lub całej komórki, zawsze immobilizowany; 1 kg enzymu → 10.000 kg produktu (3$/1 kg).

R E G I O S E L E K T Y W N O Ś Ć

Zdolność odróżniania grup funkcyjnych znajdujących się w różnych regionach tej samej cząsteczki.

Hydroksylacja steroli:

C H E M I S E L E K T Y W N O Ś Ć

Zdolność do rozróżniania określonych grup funkcyjnych spośród grup o podobnej lub wyższej reaktywność.

Hydroliza nitryli:

2. Enzymy pracują w łagodnych warunkach- minimalizacja niepożądanych reakcji ubocznych (dekompozycja, racemizacja, izomeryzacja).

Produkcja akrylamidu:

• proces chemiczny

• temp: 80-180°C

• produkt uboczny (kwas akrylowy)

• katalizator miedziowy (toksyczność)

3. Kataliza enzymatyczna jest „przyjazna środowisku”.

4. Przyspieszanie reakcji chemicznej o wartość 10^-9-10^-10

ZARZUTY WOBEC ENZYMÓW:

1. Działają tylko w środowisku wodnym (kłamstwo- biokataliza w układach dwufazowych i niewodnych).

2. Cena enzymów.

3. Stabilność enzymów:

BIOKATALIZATOR	OKRES PÓŁTRWANIA
Aspartaza	6 m. - 2 l.
Fumaraza	180 dni
Deaminaza Arg	140 dni
Transaminaza	90 dni
Amidaza penicylazy	> 6 m.
Proteaza	> 60 dni
Izomeraza glukozy	> 60 dni

4. Wydajność reakcji katalizowanych przez enzymy:

• reakcje wysokowydajne:

• produkcja L-Asp przez immobilizowaną aspartazę

• produkcja L-Phe przez amidazę lub transaminazę

• produkcja L-tert-Leu przez dehydrogenazę leucynową w reaktorze membranowym

• produkcja kwasu 2-chloropropionowego z użyciem lipaz

• Regeneracja kofaktorów:

• metoda regeneracji NAD⁺:

• dodatkowa reakcja chemiczna




• reaktor membranowy (zwiększenie masy kofaktora), np. otrzymywanie

L-tert-Leu:




• zastosowanie całych komórek:

• źródło węgla napędzające komórkę

• alkohole wykorzystywane do produkcji leków benzodiazepinowych

• 2 kg glukozy / kg produktu




• stereoselektywna redukcja 2-podstawionych-β-ketoestrów




6. Enzymy nie katalizują przemysłowo atrakcyjnych reakcji:

1. kwasy tłuszczowe

2. syropy fruktozowe

3. aspartam

4. akrylamid

5. 6-APA

6. aminokwasy

7. cyklodekstryny

8. S-2-chloropropionian

Forma katalizatora		ZALETY	WADY
ENZYMY		prosta aparatura, tolerancja na wysokie stężenia substratów i produktów	niezbędny system regeneracji kofaktora
		reakcja w roztworach wodnych	wysoka aktywność	produkty uboczne, substraty nierozpuszczalne w wodzie, ekstarkcja
		reakcja w rozpuszczalnikach organicznych	łatwa procedura, substraty rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, łatwe odzyskanie enzymu	niska aktywność
		immobilizowane	łatwe odzyskanie enzymu	utrata aktywności podczas procesu immobilizacji
	KOMÓRKI		brak systemów regeneracji kofaktora	sprzęt, obróbka dużych objętości, niższa tolerancja na reagenty-niższa produktywność, niska tolerancja na rozpuszczalniki organiczne, reakcje uboczne
		kultury rosnące	aktywność	duża biomasa, produkty uboczne
		kultury spoczynkowe	łatwa obróbka, mniej produktów ubocznych	niska aktywność
		immobilizowane	wielokrotność użycia	niska aktywność

WYKORZYSTANIE ENZYMÓW W PRZEMYŚLE

1. Optycznie czynne:

1. D-p-hydroksymetyloglicyna (prekursor semisyntetycznych penicylin i cefalosporyn)




2. Produkcja akrylamidu.




proces mikrobiologiczny:




- Rhodococcus rhodochrous (również produkcja nikotynamidylu z 3-cyjanopirydyny)

• H-NHaza 520 kDa- mocznik jako induktor, substraty alifatyczne

• L-NHaza 130 kDa- cykloheksanokarboksyamid, substraty aromatyczne

• Krotonamid- obie formy

3. Produkcja kwasu D-pantotenowego.




PL- lakton pentyloway

PA- kwas pantoteinowy

DL-PD- hydroliza enzymatyczna → ekstrakcja → D-PA → obróbka → D-PL

↓

L-PL → obróbka → DL-PL

• suszona mycelia Fusarium oxysporum

• 70% roztwór form L i D PL w pH 7 przez 20 h izomer D jest całkowicie hydrolizowany

4. Produkcja hydroksyproliny.

• trans-4-hydroksy-Pro

• hydriksylacja Pro (8 izomerów)

• hydroksylaza z Dactylosporangium sp. (RHI-trans-4-hydroksy-1-Pro)

• hydrolaza z Streptomyces sp. (TH2-cis-3-hydroksy-1-Pro)

• dioksygenazy, askorbinian

SPOSOBY ZASTOSOWANIA ENZYMÓW W R. CHEMICZNYCH

1. Typowe reakcje w roztworach wodnych.

2. Enzymy immobilizowane.

3. Reakcje w układach dwufazowych.

4. Reakcje w rozpuszczalnikach organicznych.

ENZYMY W ROZPUSZCZALNIKACH ORGANICZNYCH

Zastosowanie układów niewodnych:

• umożliwia rozpuszczanie hydrofobowych substratów

• przesuwa równowagę reakcji w stronę reakcji syntezy a nie hydrolizy (synteza estrów, peptydów, laktonów)

• daje możliwość uniknięcia niepożądanych reakcji ubocznych zachodzących w obecności wody

• daje możliwość uniknięcia procesu immobilizacji (łatwy odzyski nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych enzymów

• w przypadku, gdy immobilizacja jest niezbędna wystarczy immobilizacja na porowatych powierzchniach

• łatwy odzysk produktu

• wzrost termostabilności enzymów

• obniżone ryzyko zakażenia mikrobiologicznego

Badania zastosowania enzymów w roztworach organicznych rozwijały się w kilku etapach:

• woda / rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą

• układy dwufazowe

• środowisko niewodne

Woda jest niezbędna enzymom do przyjęcia odpowiedniej konformacji.

Enzym musi być otoczony molekularną cząsteczka wodą.

PROBLEM pH

Enzymy liofilizowane bądź wytrącone z roztworów o pH optymalnym- dla ich aktywności „pamięć pH” (najlepiej liofilizować ze środowiska o pH optymalnym, bo to pH enzym „zapamięta”).

W rozpuszczalnikach organicznych nie da się zmierzyć pH- enzym będzie w takim stanie w jakim był liofilizowany (grupy jednogenne enzymu odpowiedzą na to w jakim są środowisku).

P R Z Y G O T O W A N I E B I O K A T A L I Z A T O R A

• modyfikacja kowalencyjna, np. przyłączenie PEG

• modyfikacja niekowalencyjna:

• „the ion pairing” (parowanie jonów)- niezbędne niskie stężenie surfaktantu

• liofilizacja z roztworów wodnych w obecności:

• soli nieorganicznych (KCl), np. subtylizyna Carlsberga była liofilizowana w obecności KCl, uzyskano enzym, którego aktywność w heksanie była 4000 razy wyższa

• związków organicznych (etery koronowe, cyklodekstryny)

• substratów- zmiany w specyficzności substratowej („molecular imprinting”- analog stanu przejściowego jest zmieniony tak, że uzyskuje aktywność kataliyczną)

W P Ł Y W R O Z P U S Z C Z A L N I K A N A P R O C E S B I O K A T A L I Z Y

• bezpośredni wpływ na enzym- obniżenie aktywności katalitycznej lub stabilności

• oddziaływanie na reagenty

• oddziaływanie na warstwę molekularną otaczającą enzym

J A K W Y B R A Ć R O Z P U S Z C Z A L N I K?

1. Kompatybilność rozpuszczalnika z planowaną reakcją:

• np. modyfikacja cukrów- cukry rozpuszczają się w hydrofilowych, mieszalnych z wodą rozpuszczalnikach; zastosowanie rozpuszczalnika niepolarnego jest niekorzystne ponieważ nie dojdzie do kotaktu pomiedzy substratem a enzymem

• np. oksydaza polifenolowa- w heksanie podane produkty (chinony) dążą do pozostania blisko enzymu (utrata aktywności, reakcje uboczne); zamiast heksanu stosue się chloroform.

2. Rozpuszczalnik musi być obojętny dla reakcji:

• reakcja transestryfikacji- zastosowanie rozpuszczalnika o charakterze cukru lub alkoholu- estry rozpuszczalnikowe

Miarą hydrofobowości rozpuszczalnika jest log P (P- współczynnik podziału pomiędzy etanol a wodę).

log P wysoki- rozpuszczalniki niepolarne (proszki enzymatyczne)

log P niski- rozpuszczalniki polarne

R E A K C J E E N Z Y M A T Y C Z N E Z A C H O D Z Ą C E W

R O Z P U S Z C Z A L N I K A C H O R G A N I C Z N Y C H:

1. utlenianie steroidów- sterole charakteryzują się niską rozpuszczalnością w H₂O; Nocardia rodocrous; 3-β-hydroksy-δ⁵-steroid → 3-keto-δ⁴-steroid, np.: utlenianie cholesterolu do cholestenonu (heksan:benzen 1:1)

2. reakcja epoksydacji i hydroksylacji

3. reakcja katalizowanaprzez dehydrogenazę alkoholową, np. HLADH (wątroba końska); optycznie czynne alkohole, ketony; enzym immobilizowany na szklanych kulkach, eter izopropylowy, racemiczny alkohol lub keton, regeneracja kofaktora- aldehyd izomasłowy

4. polimeryzacja fenoli

5. depolimeryzacja lignin

6. synteza estrów- lipazy jako proszki enzymatyczne lub całe komórki, estryfikacja kwasów tłuszczowych;

1. wysuszone mycelia Rhizopus arrhizus w mieszaninie oktanolu + kwasu olejowego + sita molekularne (wiążą wodę ze środowiska)

2. reakcja interestryfikacji (wymiana grup acylowych) ważna komercyjnie; produkcja masła kakaowego, niskotopliwe margaryny (topią się już w 30°C)

3. lipaza z Rhizopus nivens- przekształcanie POP (pochodna glicerolu) przy udziale stearynianu w mieszaninę związków, które są skałdnikami masła kakowego; modyfikacja triglicerydów wykorzystywana do otrzymywania niskotopliwych margaryn

7. synteza peptydów- udział wody 50% lub układ niewodny; hydrofobowe pochodne aminokwasów

1. chymotrypsyna immobilizowana na Sepharose

2. ester N-acetylo-L-Phe-o-metylowy + amid Ala (Gly) w butanodiolu (10% wody)

3. chymotrypsyna immobilizowana na chitynie katalizuje syntezę

HOOC-Tyr-Gly-NH₂ 95% acetonitrylu

8. rozdział mieszanin recemicznych- lipaza ze szczepu Candida cylindracea




W przemyśle rozdział mieszaniny racemicznej kwasów 2-halogenokarboksylowych (2-chloro i 2-bromopropionian) przy pomocy butanolu, w heksanie.

Rozdział racemicznych alkoholi przy pomocy świńskiej lipazy trzustkowej, otrzymuje się 2-oktanol, 2-dodekanol, transestryfikacja z trichloroetylomaślanem (izomer R reaguje dając czysty R-ester, izomer S wydzielony)

PERSPEKTYWY BIOKATLIZY

1. Dostosowanie biokatalitycznej cząsteczki do procesu:

• poszukiwanie nowych biokatalizatorów pochodzących z ekstremofili

• wprowadzanie zmian w molekularnej strukturze biokatalizatora (modyfikacje chemiczne, mutacje punktowe, ukierunkowana molekularna ewolucja in vivo)

• odpowiednia postać biokatalizatora

• inżynieria warunków fizycznych procesu

• inżynieria środowiska reakcji (środowisko niewodne, dwufazowe, ciecz nadkrytyczna)

2. Katalityczne biocząsteczki:

• rybozymy (RNA-zymy)- niektóre domeny natywnych cząsteczek RNA o właściwościach katalitycznych, opisane na poczatku lat 90

• deoksyrybozymy (DNA-zymy)- katalityczne DNA znalezione w kombinatoryjnych bibliotekach fragmentów jednoniciowych syntezowanych chemicznie i wyselekcjonowanych za pomocą metody Selex

• abzymy- p/ciała katalityczne; immunizacja zwierząt doświadczalnych przy pomocy analogu stanu przejściowego jakiegoś substartu (p/ciała katalityczne); droga produkcja, około 100 różnych reakcji (hydroliza, kondensacja, inne)

9

---