METODY HODOWLI BAKTERII BEZTLENOWYCH
Grupa L04
Czysta kultura to w mikrobiologii określenie hodowli, w której wszystkie organizmy są klonami jednej komórki macierzystej, tj. należą do jednego szczepu konkretnego gatunku.
Niektóre definicje podają, że czysta kultura odnosi się do hodowli, w której mamy tylko jeden gatunek mikroorganizmu, ale nie jest to do końca właściwa definicja, ponieważ trudno mówić o czystej hodowli, jeśli np. wymiesza się np. E. coli wrażliwą na ampicylinę i odporną na ten antybiotyk (w takim wypadku mamy już kulturę mieszaną).
Hodowla mieszana - drobnoustroje wyrosłe w środowisku wzrostowym należące do różnych szczepów tego samego gatunku lub różnych gatunków jednego rodzaju bądź różnych rodzajów.
W hodowli beztlenowców konieczne jest wytworzenie ujemnego potencjału oksydoredukcyjnego, który można uzyskać metodami:
1.Fizycznymi:
• odtlenianie pożywki przez zagotowanie i szybkie schłodzenie:
Obejmują m.in. usunięcie powietrza z pożywki płynnej przez jej zagotowanie i szybkie schłodzenie w strumieniu zimnej wody, później posianie ezą bakterii beztlenowej, a następnie zalanie podłoża warstwą jałowego, płynnego oleju parafinowego oraz inkubowanie przez 24 godz. w temp. 37°C.
• aparat do hodowli beztlenowców - an aerostat:
Innym skutecznym sposobem jest hodowla bakterii w an aerostacie (słoju próżniowym) w próżni lub atmosferze gazu obojętnego, np. azotu, argonu, rzadziej ze względu na koszty helu lub ze względu na bezpieczeństwo wodoru.
• hodowla na podłożu płynnym i na słupkach:
W dalszym ciągu stosuje się stosunkowo stare, ale skuteczne i przede wszystkim tanie metody hodowli beztlenowców w podłożu płynnym zawierającym tkankę roślinną lub zwierzęcą (np. podłoże Wrzoska - jest to pożywka w której tlen jest absorbowany przez kawałek wątroby lub mięśnia sercowego, pożywka ta jest oddzielona od tlenu atmosferycznego warstwą płynnej jałowej parafiny) oraz tzw. hodowle „kłute” na słupkach (pobranie igłą mikrobiologiczną zawiesiny określonego szczepu bakterii poprzez zwykłe zanurzenie jej w zawiesinie i zaszczepienie słupków agarowych przez wkłucie igły aż do dna słupka).
• łączenie tlenu:
Niezwykle efektywna jest metoda łączenia tlenu z wodorem w obecności katalizatora. W przeszłości reakcję taką można było przeprowadzić w specjalnie przeznaczonym do tego celu aparacie McIntosha i Fildesa. Obecnie dostępne są zestawy tzw. „Gas-Pak” zawierające zestaw odczynników: bromowodorem sodu i/lub dwuwęglan sodowy. Odczynniki te umieszczamy w słoju próżniowym wraz z niewielką ilością wody oraz hodowlami beztlenowców. W wyniku reakcji chemicznej bromowodorku sodu z wodą powstaje H2, który w obecności katalizatora palladowego reaguje z tlenem obecnym w eksykatorze z wydzieleniem wody. Reakcja ta zachodzi bardzo szybko, w krótkim czasie możemy uzyskać środowisko beztlenowe. Efektywność tego procesu sprawdza się za pomocą wskaźnika zawierającego błękit metylenowy, niebieski w środowisku tlenowym i bezbarwny po usunięciu tlenu ze słoja. Niektóre bakterie beztlenowe wyrastają lepiej w środowisku zawierającym CO2, stąd do hodowli takich komórek należy stosować Gas-Pak z dwuwęglanem sodowym, który po reakcji z H2O daje CO2.
2. Chemicznymi:
W hodowlach beztlenowców możemy stosować podłoża zawierające substancje chemiczne absorbujące tlen, np. pirogallol (trioksybenzen), podsiarczyn sodowy, chlorek miedziowy, a także związki chemiczne obniżające potencjał oksydoredukujący, np. kwas askorbinowy, tioglikolan sodowy, cysteinę, siarczyn sodowy. Przykładami takich podłóż mikrobiologicznych stosowanych w praktyce są m.in. podłoże tioglikolanowo-sojowe i podłoże VL z chlorowodorkiem cysteiny.
3. Biologicznymi:
W tej metodzie stosujemy hodowle, na tym samym podłożu, dwóch drobnoustrojów - tlenowca i beztlenowca. Bakterie posiewamy na dwie oddzielone od siebie (poprzez wycięcie skalpelem ze środka paska pożywki) połówki płytki agarowej Fortnera, zawierające bulion cukrowy z dodatkiem 3% krwi owcy. Płytkę szczelnie oklejamy plasteliną lub plastrem i inkubujemy w temp. 37°C przez 24 godz. Najpierw, korzystając z obecności tlenu w środowisku wzrostu wyrośnie tlenowiec, który wykorzystując O2 stworzy warunki odpowiednie do wzrostu beztlenowca.