Aleksandra Gatlik, Jan Idzik 26.10.2009

Biotechnologia, wydział: AEiI,

gr. dziekańska: Aut2

sekcja: 11

Sprawozdanie z ćwiczenia 2, z dnia 20.10.2009

Izolacja białek wiążących DNA metodą chromatografii powinowactwa

I Wstęp

Chromatografia powinowactwa to technika rozdziału składników mieszaniny (np. białek) przy wykorzystaniu różnic w ich wiązaniu się do odpowiednio dobranego złoża.

Chromatografię powinowactwa przeprowadza się zwykle w dwóch etapach.

W pierwszym etapie przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający molekuły komplementarne do liganda. Przemieszczające się w obrębie złoża molekuły odnajdują unieruchomiony ligand i wiążą się z nim. Po odmyciu nieswoiście zaadsorbowanych molekuł rozpoczyna się drugi etap, w którym dochodzi do dysocjacji powstałych kompleksów i elucji swoiście związanych makromolekuł.

II Przebieg ćwiczenia

• Otrzymane na poprzednich ćwiczeniach ekstrakty EJ rozmrożono na lodzie. Delikatnie zamieszano.

• Próbki odwirowano (4⁰C; 15min; maksymalne obroty).

• Otrzymany po wirowaniu supernatant przeniesiono do nowych probówek (EJ1) Osad zawieszono w 10μl 4xSB
  i zamrożono.

• Zmierzono objętość roztworu w probówce EJ1 - 500 μl.

• Z probówki EJ1 pobrano --> 800μg - 255 μl [Author:A] białka do osobnej probówki (EJ2).

• Do probówki EJ2 dodano 255 μl buforu do rozdziału bez NaCl (20 mM tris HCl pH 7.5; 5% glicerol; 5 mM MgCl₂; 1 mM DTT). W ten sposób otrzymano roztwór o stężeniu NaCl równym 0,2M (początkowe stężenie NaCl EJ z ćwiczenia I to 0,4M).
  Z probówki zawierającej DNA-celulozę zebrano i odrzucono nadsącz. Całą zawartość probówki EJ2 naniesiono na DNA-celulozę i silnie zworteksowano.

• Probówkę wytrząsano 45min w 4⁰C na kołysce.

• Probówkę odwirowano (4⁰C; 3 min; 1700xg). Supernatant przeniesiono do probówki opisanej EJ-NZ (niezwiązane). Zmierzono objętość supernatantu: 560 μl.

• Do osadu dodano 120μl buforu do rozdziału 0.2M NaCl. Zworteksowano i odwirowano (4⁰C; 3min; 1700xg). Supernatant przeniesiono do probówki opisanej EJ-F1. Zmierzyć objętość supernatantu: 150 μl.

• Do osadu dodano 120μl buforu do rozdziału 0.2M NaCl. Zworteksowano i odwirowano (4⁰C; 3min; 1700xg). Supernatant przeniesiono do probówki opisanej EJ-F2. Zmierzyć objętość supernatantu: 120 μl.

• Do osadu dodano 120μl buforu do rozdziału 0.8M NaCl. Zworteksowano i odwirowano (4⁰C; 3min; 1700xg). Supernatant przeniesiono do probówki opisanej EJ-F3. Zmierzyć objętość supernatantu: 120 μl.

• Z próbki EJ-NZ pobrano 5μl roztworu i oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (z wykorzystaniem wzoru: C [μg/μl] = A₅₉₅ x b : c)

• Z próbek EJ-F1, EJ-F2, EJ-F3 pobrano po 20μl roztworu i oznaczyć stężenie białka metodą Bradford.

	Wyniki ze spektrofotometru A595	C [μg/μl]	Ilość białka w próbce [μg]
NZ	0,039	0,126	70,761
F1	0,070	0,057	8,505
F2	0,054	0,044	5,249
F3	0,079	0,064	7,679

Bilans izolacji białek wiążących DNA na DNA-celulozie:

	Ilość białka [μg]	% białka nałożonego na DNA-celulozę
Białko nałożone na DNA-celulozę	800	100
Białko niezwiązane z DNA-celulozą (NZ)	70,761	8,85
Białko niespecyficznie związane z DNA-celulozą (wypłukane 0.2M NaCl) (F1+F2)	13,753	1,72
Białko specyficznie związane z DNA-celulozą (wypłukane wyższymi stężeniami NaCl) (F3 i kolejne)	7,679	0,96

Sumaryczna ilość białka uzyskana w poszczególnych frakcjach stanowi jedynie trochę ponad 10% ilości białka naniesionego na DNA-celulozę. Wynika to z dużego powinowactwa białek ekstraktu jądrowego do DNA. Wśród białek tych występują przede wszystkim białka histonowe wiążące DNA, a także występujące w jądrze polimerazy również oddziałujące z DNA. Dwukrotne wirowanie probówki zawierającej białka naniesione na DNA-celulozę z buforami o stężeniach 0.2 M i 0,8 M okazało się niewystarczające do oddzielenia tych białek od adsorbenta. Być może większa liczba wirowań, która nie została przeprowadzona z powodu ograniczonego czasu na wykonanie ćwiczenia poskutkowałaby odzyskaniem większej części umieszczonego na początku w probówce białka. Być może siły, z jakimi białka ekstraktu jądrowego wiążą się z DNA --> są zbyt duże[Author:A] , aby zastosowany bufor mógł je skutecznie od siebie oddzielić.

Ilość białek wiążących DNA w ekstraktach jądrowym i cytoplazmatycznym powinna być z pewnością różna, trudno jednak jednoznacznie określić o ile mniej białek wiążących DNA powinno występować w ekstrakcie cytoplazmatycznym. W zależności m.in. od tego, w jakim momencie cyklu komórkowego znajduje się komórka, gdy zostaje poddana lizie, w cytoplazmie mogą znajdować się różne ilości białek jądrowych, które są tam syntezowane a później transportowane do wnętrza jądra. Oprócz białek jądrowych białka wiążące DNA mogą pochodzić również z mitochondriów, a białka mitochondrialne występują w ektrakcie cytoplazmatycznym. Podczas przeprowadzania procesów izolacji przez --> niedoświadczonych studentów[Author:A] , nieuniknione jest również zanieczyszczenie ekstraktu jądrowego białkami pochodzącymi spoza jądra komórkowego, co dodatkowo wpływa na zmniejszenie różnic pomiędzy obydwoma ekstraktami.

Gdzie SA obliczenia?

elucja bialek roztworem o stężeniu 0.8M NaCl wystarcza aby wyplukac nawet te bbialka które SA mocno związane z DNA

proszę się w taki sposób nie tlumaczyc

---