Biosynteza białka
Budowa kwasów nukleinowych
Nukleotydy - produkty hydrolizy kwasów nukleinowych (RNA i DNA) przez rybonukleazy, deoksyrybonukleazy i polinukleotydazy
1. składają się z: zasady organicznej + pentoza + fosforan
zasady pirymidynowe: cytozyna, tymina, uracyl
zasady purynowe: adenina, guanina
pentozy: ß-D-ryboza i - ß -D-2-deoksyryboza
2. połączone są wiązaniami 3',5`-fosfodiestrowymi, tworząc łańcuch cukrowo-fosforanowy o przemiennie powtarzających się resztach deoksyrybozy i fosforanu.
Nukleozydy - produkty hydrolizy nukleotydów (nukleotydazy i fosfatazy) są rozkładane przez fosforylazy jelitowe.
1. składają się z: zasady organicznej + pentoza
2. połączone są wiązaniami N-glikozydowymi
Rodzaje RNA
W komórkach występują trzy główne klasy RNA:
1. informacyjny (mRNA) - 5%
2. rybosomowy (rRNA) - 80%
3. transportujący (tRNA).
W komórkach eukariotycznych znajdują się dodatkowo małocząsteczkowe RNA (w postaci rybonukleoprotein):
1. małe jądrowe RNA - snRNA - bierze udział w dojrzewaniu transkryptu
2. mikro RNA - miRNA - hamuje ekspresję genów
3. małe interferujące RNA - siRNA - hamuje ekspresję genów
Niektóre cząsteczki RNA mają wewnętrzną aktywność katalityczną (rybozymy), co jest związane z cięciem kwasu nukleinowego, np. działanie RNA w procesie składania pierwotnego transkryptu genu w „dojrzaly” mRNA.
Rodzaje DNA
rybosomalny DNA (rDNA) - występuje głównie w jąderku, w czasie kariokinezy skupiony jest w przewężeniu wtórnym chromosomów jąderkotwórczych
2. satelitarny DNA (satDNA) - w czasie kariokinez współtworzy centromer i satelitę
3. unikalny DNA - najistotniejsza część euchromatyny - frakcja DNA która jest aktywna genetycznie dwa oddzielne łańcuchy DNA są owinięte wokół siebie, tworząc dwuniciową prawoskrętną antyrównoległą względem siebie helisę dwie nici DNA są utrzymywane razem przez wiązania wodorowe występujące w parach komplementarnych zasad.
Struktura przestrzenna DNA obejmuje 4 poziomy:
Pierwszorzędowa
Drugorzędowa
Trzeciorzędowa
Czwartorzędowa
W komórkach eukariotycznych DNA jest zawarty w jądrach, a olbrzymia jego większość jest ściśle upakowana w chromosomach. W chromosomach obok DNA występują również białka - większość to histony, pozostałe - białka niehistonowe.
Jądrowy kompleks DNA i białek nazywamy chromatyną.
Jest pięć poziomów zorganizowania chromatynowego włókna:
1. heliks DNA
2. włókno nukleosomowe (nukleosom)
3. włókno solenoidowe
4. chromatyna interfazowa
5. chromatyna metafazowa
REPLIKACJA DNA
1. Proces enzymatyczny katalizowany przez polimerazy DNA.
2. Proces semikonserwatywny - synteza nowych łańcuchów DNA zachodzi zawsze z zachowaniem łańcuchów starych (rozdzielone są dokładnie kopiowane w czasie syntezy i dają dwie nowe cząsteczki).
3. Przebiega tylko w kierunku 5' 3' (jedynie w tą stronę działają polimerazy DNA).
Obie macierzyste nici, służące jako matryce do syntezy DNA są zorientowane w przeciwnych kierunkach, zatem tylko jedna z nici potomnych może się wydłużać w sposób ciągły zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych. Demontaż chromatyny w celu skopiowania DNA opóźnia przesuwanie się widełek i powoduje powstawanie krótkich fragmentów nici opóźnionej.
Inicjacja replikacji
U Prokariota:
Rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu chromosomu -replikonie (jest to jednostka genomu, w obrębie której DNA ulega replikacji). Zainicjowanie replikacji i rozwinięcie podwójnego heliksu rozpoczyna się w specjalnych miejscach tj. miejscach zainicjowania replikacji (miejsca inicjacji ori -powstaje „oczko” lub „bąbel” replikacyjny).
Niezbędne są w tym celu: helikazy (rozrywają wiązania wodorowe między parami zasad w łańcuchu DNA) i białka SSB, pomagające utrzymać z dala od siebie rozdzielone pojedyncze nici rozwiniętego podwójnego heliksu. Wyróżnia się 2 typy nici potomnych:
- nić prowadząca (wiodąca lub wyprzedzająca) - syntetyzowana w w sposób ciągły w kierunku od 5` do 3` i zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych
- nić opóźniona - syntetyzowana w sposób nieciągły, w kierunku przeciwnym do ruchu widełek, w postaci krótkich fragmentów, nazywanych fragmentami Okazaki (ok. 1000 nukleotydów) łączonych później kowalencyjnie przez ligazy DNA.
Wszystkie znane polimerazy DNA katalizują tylko reakcję wydłużania istniejących już fragmentów, nie mogą jednak rozpocząć ich syntezy. Do rozpoczęcia pracy polimerazy DNA potrzebny jest starter RNA (primer) - jest to krótki fragment RNA zbudowany z 10 nukleotydów, zakończonych resztą trójfosforanową przy 5' i komplementarny do matrycy DNA.
U Eukariota:
U organizmów wyższych jest wiele replikonów czyli wiele miejsc replikacji - setki a nawet tysiące bąbli replikacyjnych. Przed skopiowaniem DNA w widełkach replikacyjnych musi zostać odwinięty z nukleosomów. Opóźnia to przesuwanie się widełek replikacyjnych do ok. 50 pz na sek. Cały ten proces prowadzi do aktywacji miejsc inicjacji i wytworzenia widełek replikacyjnych, co w efekcie prowadzi do jednorazowego podwojenia całej ilości DNA chromosomu.
Wyróżnia się polimerazy DNA:
- polimeraza α i δ - udział w replikacji: synteza nici opóźnionej (α) i wiodącej (δ)
- polimeraza β i ε - udział w naprawianiu DNA, dodatkowo ε sprawdza poprawność syntezy DNA
- polimeraza γ - replikacja DNA mitochondrialnego
Startery DNA są syntetyzowane przez polimerazę DNA α.
Elongacja replikacji
1. Wydłużanie starterów na niciach wiodącej polimerazę DNA III 2. Usuwanie starterów, wypełnianie przerw i synteza nici opóźnionejprzez polimerazę DNA I. Ten enzym ma na jednym łańcuchu polipeptydowym następujace aktywności: polimerazy 5'3', egzonukleazy 5'3' (usuwa startery, podczas gdy aktywność polimerazy równocześnie wypełnia powstałe wskutek tego luki, poprzez wydłużanie końca 3' sąsiedniego fragmentu Okazaki).
3. Polimeraza II sprawdza poprawność syntezy DNA i naprawia DNA.
4. Powstawanie wiązań fosfodiestrowych między kolejnymi fragmentami Okazaki katalizuje ligaza DNA.
Terminacja replikacji
Końcowy etap syntezy DNA wymaga połączenia powstałych nici w kompletne chromosomy i rozdzielenia ich między komórki potomne. Replikacja kończy się w momencie zetknięcia dwóch widełek replikacyjnych przesuwających się w przeciwnych kierunkach kolistego chromosomu.
U Eukariota:
Do replikacji końców chromosomów (telomerów) potrzebna jest telomeraza, będąca polimerazą DNA, zawierająca swój własny RNA, który służy jako matryca do syntezy powtarzających się krótkich sekwencji telomerowego DNA (podtrzymanie długości telomerów).
TRANSKRYPCJA
1. Synteza jednoniciowego RNA na matrycy DNA - jedna z dwóch nici DNA jest transkrybowana i informacja zawarta w sekwencji nukleotydów DNA zostaje przepisana komplementarnie na RNA (mRNA), a jego sekwencja odpowiada sekwencji nici DNA zwanej nicią sensowną (dsDNA).
Matrycowy RNA (mRNA)
- ma zdolność do tworzenia kompleksów z rybosomami
- służy jako matryca w biosyntezie białka
- w środkowej części cząsteczki mRNA znajdują się sekwencje kodujące rozpoczynające się kodonem inicjującym translację AUG i kończąc się kodonem terminacyjnym UAA, UAG, UGA.
2. Katalizowana przez polimerazę RNA (u prokariontów jedna u eukariontów trzy rodzaje enzymu), która wymaga matrycy dsDNA i prekursorowych rybonukleotydów: ATP, GTP, CTP i UTP oraz jonu magnezowego jako kofaktora.
Synteza RNA przebiega w kierunku od 5' do 3'.
Polimerazy RNA - należą do metaloenzymów zawierających jon cynkowy.
U eukariota występują trzy rodzaje polimeraz transkrybujących różne klasy genów:
I - transkrybuje rRNA
II - mRNA i snRNA
III - tRNA i rRNA
Inicjacja transkrypcji
Do rozpoczęcia transkrypcji polimeraza RNA nie wymaga startera. Matryce DNA zawierają rejony zwane promotorami, które w specyficzny sposób wiążą polimerazy RNA i determinują miejsce startu transkrypcji.
U Prokariota miejsca promotorowe to:
sekwencja TATAAT (kaseta Pribnowa), położona w rejonie -10 (tj. w odległości 10 nukleotydów przed pierwszym nukleotydem ulegającym transkrypcji, oznaczonym +1).
sekwencja TTGACA, położona w rejonie -35 Pierwszy transkrybowany nukleotyd zwykle jest purynowy.
U Eukariota miejsce promotorowe to:
sekwencja TATAAA nazywana kasetą TATA (kaseta Hognessa), położona w rejonie -25.
sekwencja CAAT, położona w rejonie -75.
Większość eukariotycznych genów kodujących białka jest nieciągła. Kodujące odcinki genu, zwane eksonami, są porozdzielane niekodującymi odcinkami DNA, określanymi jako introny.
Elongacja transkrypcji
Polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż DNA i zgodnie z jego sekwencją syntetyzuje łańcuch RNA. Odcinek DNA przed przemieszczającą się polimerazą ulega rozpleceniu i splata się ponownie za nią.
Terminacja transkrypcji
Polimeraza RNA przemieszcza się aż osiągnie miejsce terminacji transkrypcji, zwane sekwencją terminacyjną
stanowi sygnał zakończenia transkrypcji
może przybierać strukturę typu spinki w nowo syntetyzowanym łańcuchu RNA.
Dojrzewanie RNA u Eukariota
1. Koniec 5` pierwotnych transkryptów ulega modyfikacji, w wyniku której grupa 5`-OH transkryptu zostaje połączona z grupą 5`-OH 7-metyloguanozyny poprzez trifosforan.
2. Poliadenylacja końca 3` - pierwotny transkrypt, zostaje w pobliżu końca 3` rozcięty przez endonukleazę, a następnie zostaje do niego przyłączony poliadenylowy „ogon” poli (A) zawierający 100-200 reszt A - substratem są cząsteczki ATP. Ogon poli (A) stabilizuje mRNA, chroniąc jego koniec przed trawieniem przez rybonukleazy.
3. Splicing (składanie) - precyzyjne wycinanie sekwencji intronowych i łączenie końców sąsiadujących eksonów.
4. Redagowanie RNA -pojedyncze nukleotydy w obrębie mRNA mogą ulegać wymianie na inne, mogą nastąpić delecje lub mogą być wprowadzone dodatkowe nukleotydy. Rezultatem tego jest taka zmiana mRNA, że koduje on polipeptyd różny od kodowanego przez oryginalny gen.
TRANSLACJA
Ostatni etap ekspresji informacji genetycznej w komórce - informacja zaszyfrowana w łańcuchu mRNA za pośrednictwem „adaptorowych” cząsteczek tRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w białku. Jest to możliwe dzięki tworzeniu par zasad między sekwencjami nukleotydowymi mRNA - kodonami -a komplementarnymi do nich sekwencjami nukleotydowymi tRNA - antykodonami.
Transportujący RNA (t-RNA)
1. Pełni funkcję cząsteczki adaptorowej - dostarcza aminokwasy do rybosomu i dekoduje mRNA.
2. Rozpoznaje aminokwas i odpowiadający mu kodon w mRNA
3. Przenosi enzymatycznie związany odpowiedni aminokwas do tworzącego się na rybosomie łańcucha polipeptydowego
4. Budowa
Struktura I rzędowa - sekwencja liniowa. Pojedynczy łańcuch zbudowany z 63 do 94 nukleotydów wśród których występuje ponad 20 nukleozydów niespotykanych w innych kwasach nukleinowych m.in. tymidyna, pseudourydyna, dihydrourydyna czy rybotymina.
Struktura II rzędowa -zawiera cztery lub pięć podwójnych łańcuchów, stabilizowanych wiązaniami wodorowymi oraz trzy lub cztery jednoniciowe pętle:
- pętla I- dihydrourydylowa (pętla D lub DHU) - zawiera 8-12 nukleotydów nie tworzących par komplementarnych. Sądzi się, że znaczna część tej pętli łączy się ze swoistym enzymem aktywującym syntetazą aminoacylową
- pętla II-antykodonowa, obejmuje 7 niekomplementarnych nukleotydów, a wśród nich trzy przyległe, stanowiące antykodon, których zasady tworzą pary z trzema zasadami azotowymi kodonu w mRNA
pętla III-dodatkowa, cechuje się bardzo zmienną wielkością pętla IV- tzw. pseudourydylowa składa się z siedmiu nukleotydów nie tworzących par zasad i dzięki specyficznej budowie prawdopodobnie odpowiada za przyłączanie się cząsteczki tRNA do powierzchni rybosomu.
Struktura III rzędowa - dziewięć wiązań wodorowych utworzonych pomiędzy zasadami znajdującymi się w rejonach jednoniciowych pętli tRNA pakuje strukturę II rzędową w strukturę III rzędową w kształcie litery L.
Rybosomowy RNA (rRNA)
1. Prowadzi syntezę polipeptydów.
2. Jeden rybosom może na raz prowadzić syntezę jednego łańcucha polipeptydowego
3. Większość białek rybosomowych to białka zasadowe, które łatwo łączą się z RNA.
I etap - aktywacja aminokwasu
1. Każdy aminokwas jest dołączany poprzez swoją grupę karboksylową do 3' końcowego hydroksylu w tRNA - proces ten katalizują enzymy aminoacylo tRNA syntetazy.
Proces jest dwuetapowy:
aminokwas + ATP aminoacyloAMP
aminoacyloAMP + tRNA aminoacylo-tRNA + AMP
2. Energia dla tej reakcji pochodzi z ATP.
II etap - synteza łańcucha polipeptydowego na rybosomie
Obejmuje trzy stadia:
1. inicjacja - zapoczątkowanie syntezy łańcucha polipeptydowego
2. elongacja - wydłużanie syntetyzowanego łańcucha polipeptydowego o dalsze aminokwasy przynoszone przez kolejne cząsteczki tRNA
3. terminacja - zakończenie syntezy łańcucha polipeptydowego oraz jego uwolnienie z rybosomu
Inicjacja translacji
1. Rybosom rozpoznaje w mRNA kodon AUG, od którego rozpoczyna się synteza polipeptydu
2. Inicjacja decyduje o prawidłowym odczytaniu informacji genetycznej, zawartej w mRNA - rybosom i inicjatorowy tRNA muszą rozpoznać w mRNA właściwe miejsce rozpoczęcia syntezy polipeptydu.
U Eukariota:
Jest zaangażowanych 9 czynników IF. Wiążą się one do podjednostki rybosomowej lub do mRNA, dostarczają inicjatorowy tRNA lub usuwają inne czynniki. Aminokwasem inicjującym jest metionina.
Tworzenie kompleksu inicjacyjnego u Procariota
Proces trójetapowy w którym dochodzi do hydrolizy GTP, uczestniczą w nim:
czynniki inicjacyjne IF-1, IF-2, IF-3,
podjednostki rybosomu 30S i 50S.
I etap powstawanie kompleksu preinicjacynego złożonego zczynnika IF-1, IF-3 oraz podjednostki 30S. Kompleks ten wiąże się z dużym powinowactwem z rejonem startu translacji blisko końca 5'mRNA, zawierającym pierwszy inicjacyjny kodon (AUG).
II etap powstawanie kompleksu inicjacyjnego
Kompleks złożony z odpowiedniego naładowanego tRNA i IF-2 połączonego z GTP przyłącza się do kompleksu inicjacyjnego.
III etap - hydroliza GTP (powstaje GDP i Pi)
Odłączają się wszystkie czynniki inicjacyjne, podjednostka 50S łączysię z 30S i powstaje funkcjonalny kompleks inicjacyjny.
Elongacja translacji
Rybosom przesuwając się wzdłuż łańcucha mRNA katalizuje dołączanie aminokwasów do N-końca polipeptydu. Przebiega w trzech etapach powtarzających się - cykl elongacyjny.
I etap
- w miejsce A rybosomu wnika odpowiedni aminoacylo-tRNA, którego tożsamość determinuje drugi kodon w mRNA; w przyłączeniu uczestniczy czynnik elongacyjny EF-Tu i GTP.
- gdy aminoacylo-tRNA zajmie swoje miejsce i połączy się z kodonem 2, GTP ulega hydrolizie i kompleks EF-Tu z GDP opuszcza rybosom.
- regeneracja uwolnionego kompleksu EF-Tu GDP przez EF-Ts. (EF-Ts usuwa GDP z kompleksu EF-Tu GDP, by następnie zostać usuniętym przez GTP).
powstały kompleks EF-Tu GTP jest zdolny do związania kolejnego aminoacylo-tRNA i dostarczenia go do rybosomu. Wszystkie aminoacylo-tRNA mogą tworzyć kompleks z EF-Tu, z wyjątkiem inicjatorowego tRNA.
II etap - tworzenie wiązania peptydowego
miejsce A oraz P rybosomu jest zajęte przez aminokwasy, następuje atak nukleofilowy grupy α aminowej aminokwasu w miejscu A na grupę karbonylową pierwszego aminokwasu. Powstaje dipeptydylo-tRNA w miejscu A i wolny inicjatorowy tRNA w miejscu P.
Peptydylotransferaza tworzy wiązanie peptydowe. Energia do tej reakcji pochodzi od ATP wykorzystanego w reakcji aminoacylacji tRNA.
III etap - translokacja
przesunięcie się rybosomu o trzy nukleotydy (jeden kodon) w kierunku końca 3'. W miejscu A rybosomu znajduje się kodon 3. Konieczna jest do tego hydroliza cząsteczki GTP i udział czynnika elongacyjnego EF-G.
dipeptydylo-tRNA pozostaje związany z kodonem 2 mRNA, ale na skutek translokacji rybosomu znajduje się teraz w jego miejscu P.
miejsce A rybosomu zostaje opróżnione i może przyjąć następny aminoacylo-tRNA w miejscu E leży uwolniony zdeacylowany tRNA
Terminacja
pojawienie się jednego z trzech kodonów terminacyjnych UAA, UAG lub UGA w miejscu A rybosomu.
w miejsce A rybosomu wnikają białkowe czynniki terminacyjne i zmieniając specyficzność peptydylotransferazy, powodują zakończenie traslacji - przeniesienie polipeptydu na cząsteczkę wody i uwolnienie nowego białka.
U procariota występują trzy rodzaje czynników uwalniających:
RF-1 - rozpoznaje kodony UAA i UAG,
RF-2 - rozpozanje UAA i UGA,
RF-3 - jest białkiem wiążącym GTP, stymulującym oddziaływanie RF-1 i RF-2 z miejscem A zawierającym kodon stop.
U eukariota istnieje jeden czynnik uwalniający eRF, który jest białkiem hydrolizującym GTP i pełni te same funkcje co RF-1, 2 i 3 łącznie.
Kod genetyczny + inhibitory białek - do samodzielnego opracowania