22.10.2008

XXXXXXXXXXXXXX, sem. XXXXXXXX

Grupa XXXXXXXx

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

Ćwiczenie nr 2

BIALKA

Wykonanie:

XXXXXXXXXX

XXXXXXXXXXXX

1. Wstep teoretyczny

Cel ćwiczenia: Celem tego ćwiczenia jest zapoznanie z właściwościami fizycznymi I chemicznymi różnych białek.

Białka, zwanie inaczej proteinami, to polipeptydy zaliczane do biopolimerów. Sa one wielkocząsteczkowymi substancjami naturalnymi o złożonej budowie, będącymi nieodzownymi składnikami wszelkiej żywej materii, zbudowanymi z około dwudziestu różnych aminokwasów połączonych ze sobą za pomocą wiązań peptydowych.

Są również zasadniczymi elementami metabolicznymi i strukturalnymi komórek, tkanek i narządów organizmów żywych. Obecność białek stwierdzono we wszystkich komórkach żywych, a także u wirusów jako istotny składnik ich "organizmu". 

Białka są syntetyzowane na podstawie DNA a ich budowa oraz związana

z nią struktura jest uwarunkowana kolejnością zasad azotowych w łańcuchu cząsteczki kwasu nukleinowego. Białka, podobnie jak kwasy nukleinowe są wielkocząsteczkowymi polimerami, złożonymi z liniowo połączonych cząsteczek aminokwasów. Liczba kombinacji 20 rodzajów aminokwasów dla przeciętnego białka jest praktycznie nieskończona.

Syntetyzowane są one częściowo z aminokwasów endogennych, które ustrój może sam produkowac oraz z aminokwasów egzogennych, które sa pobierane z pokarmów rozkładanych w procesie trawienia.

Białka sa związkami, których masa wynosi od 10 do nawet 1000 kDa (kilodaltonow), gdzie 1Da wynosi 1/12 masy izotopu atomu węgla C-12.

Możemy wyróżnić cztery struktury przestrzenne białek.

Struktura pierwszorzędowa- jest określona przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu. Różne usytuowanie łańcucha polipeptydowego w przestrzeni decyduje natomiast o wtórnej strukturze białka.

Struktura drugorzędowa- określa ułożenie utworzonych łańcuchów w przestrzeni. Sa to lokalne struktury powstające w wyniku tworzenia się wiązań wodorowych pomiędzy tlenem grupy >C=O, a wodorem grupy -NH, dwóch niezbyt odległych od siebie w łańcuchu wiązań peptydowych.

Struktura trzeciorzędowa- określa najkorzystniejsze uporządkowanie przestrzenne części białka z punktu widzenia energetycznego.

Struktura czwartorzędowa- to przestrzenna budowa białka zbudowanego z kilku łańcuchów polipeptydowych oraz zawierająca struktury niebiałkowe. W utrwaleniu struktury wtórnej białka uczestniczą wiązania wodorowe, disiarczkowe, jonowe, tioestrowe oraz estrowe. Struktura białek warunkuje ich fizyczne, chemiczne, a co z tym ściśle związane, biologiczne właściwości poszczególnych białek.

Wszystkie białka, niezależnie od pochodzenia czy funkcji maja pewne cechy wspólne:

• Sa związkami czynnymi optycznie.

• Maja własności amfoteryczne.

• Posiadają zbliżony skład pierwiastkowy.

• Ulegają denaturacji.

• Ich roztwory sa hydrofilowymi układami koloidalnymi.

Ze względu na strukturę chemiczną białka możemy podzielić na:

- Białka proste- zbudowane wyłącznie z reszt aminokwasów;

- Białka złożone- gdzie oprócz reszt aminokwasów zawierają składniki niebiałkowe;

Pod względem rozpuszczalności białka możemy podzielić na następujące typy:

- Albuminy- Sa one dobrze rozpuszczalne w wodzie jak i w rozcieńczonych roztworach soli, kwasow i zasad.

- Globuliny- Sa nierozpuszczalne w wodzie, do rozpuszczenia potrzebują niewielkiej ilości dobrze dysocjującej na jony soli.

- Prolaminy- Rozpuszczają się tylko w 70% etanolu.

- Gluteiny- Rozpuszczają się jedynie w rozcieńczonych roztworach kwasow lub zasad.

2. Przebieg doświadczenia

2.1. ROZPUSZCZALNOSC I WYSALANIE

Jak napisałam we wstępie teoretycznym, białka w zależności od struktury charakteryzują się różną rozpuszczalnością. Dlatego tak istotny jest dobór odpowiedniego rozpuszczalnika, co decyduje o powodzeniu izolowania białek. Pokazuje nam to ćwiczenie poniżej.

Ponadto wszystkie białka sa podatne na wysalanie. Polega to na wypadaniu białek z roztworu przy znacznej ilości dobrze dysocjującej soli, łatwo tworzącej wodziany. W przypadku naszego doświadczeni sola ta jest stały (NH₄)₂SO₄.

2.1.1. Izolowanie białek roślinnych

1. Ekstrahowanie albumin i globulin.

Sposób wykonania:

1 gram maczki grochowej ekstrahowałam w 25ml 0,5M roztworu KCl przez 15 minut, od czasu do czasu wstrząsając.

Całość odwirowałam a uzyskana ciecz nadosadowa zbadałam na dwa sposoby:

- Za pomocą reakcji biuretowej, gdzie do 2 ml cieczy nadosadowej dodałam 2m 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 1% roztworu CuSo₄, miałam wykazać zawartość białka. Przy okazji tej próby reakcje biuretowa przeprowadziłam również dla roztworu białka jaja kurzego oraz dla wody w celu porównania wyników.

Obserwacje: W wyniku reakcji biuretowej kolor badanej cieczy nadosadowej zabarwił się na fioletowo.

Podobna barwę przybrał badany roztwór białka jaja kurzego.

Reakcja z woda dala kolor jasnoniebieski.

Wnioski: Fioletowy kolor otrzymany w reakcji biuretowej oznacza, iż w cieczy nadosadowej pomimo ekstrahowania, nadal znajdują się białka.

Potwierdzeniem tego jest podobny wynik uzyskany w próbie biuretowej roztworu białka jaja kurzego.

- W celu stwierdzenia obecności albumin i globulin, do dwóch probówek odmierzyłam po 1ml cieczy nadosadowej. Do probówki nr 1 dodałam 8ml wody natomiast do probówki nr 2 8ml 0,5M roztworu KCl.

Obserwacje: W probówce nr 1 zaobserwowałam wyraźne zmętnienie, natomiast w probówce nr 2 roztwór pozostał przezroczysty. Postępując według instrukcji do probówki nr 1, w której zaobserwowałam zmętnienie, dodałam parę kropli chlorku potasowego. Wytracony osad uległ rozpuszczeniu.

Wnioski: W obu probówkach miałam do czynienia z mieszanina albumin i globulin. Jak napisałam we wstepie teoretycznym, albuminy sa dobrze rozpuszczalne w wodzie, natomiast globuliny rozpuszczaja się dopiero w środowisku dobrze dysocjującej na jony soli.

W probówce nr 1 jako rozpuszczalnika użyto wody. Powstaly osad to nierozpuszczone z powodu swojego silnego momentu dipolowego czasteczki globulin. Osad rozpuścił się dopiero po dodaniu kilku kropel KCl.

W probówce nr 2 od razu użyto jako rozpuszczalnika roztworu KCl, dlatego zarówno globuliny jak i albuminy uległy rozpuszczeniu. Dlatego tez w probowce tej nie zaobserwowaliśmy żadnego zmętnienia.

2. Wydzielanie glutenu.

Sposób wykonania:

Z 30g maki pszennej i wody przygotowałam w porcelanowym moździerzu ciasto, po czym odstawiłam je na 30 minut w celu uwodnienia i spęcznienia białka. Kolejnym krokiem było wypłukanie z ciasta skrobi poprzez wygniatanie go w strumieniu zimnej wody.

Otrzymana masę rozpuściłam w 30 ml 0,2M roztworu NaOH.

Pipeta pobrałam 2ml cieczy nadosadowej i przeprowadziłam próbę biuretowa według schematu pisanego w poprzednim ćwiczeniu. Dla porównania została również przeprowadzona próba biuretowa z woda.

Obserwacje: W próbie biuretowej badany roztwór zabarwił się na kolor fioletowy.

Wnioski: Kolor fioletowy świadczy o obecności białka, w tym przypadku glutenu, w cieczy nadosadowej.

2.1.2. Wysalanie białek.

Sposób wykonania:

Do 10 ml roztworu białka kurzego dodawałam porcjami stały preparat siarczanu amonowego, az do momentu, gdy na dnie zaczęły się pojawiać kryształki, co świadczyło o nasyceniu roztworu soli. Następnie zadanie podzieliłam na dwa etapy:

- Osad przesączyłam i rozpuściłam roztworem KCl bezpośrednio na tym samym sączku. Uzyskany roztwór zbadałam metoda biuretowa na obecność białka.

- Do przesączu, który uzyskałam po oddzieleniu osadu białka dodałam 3 krople kwasu trojchlorooctowego (TCA).

Obserwacje: W próbie biuretowej roztwór zabarwił się na granatowo.

W drugiej części doświadczenia, po dodaniu TCA nie zaobserwowałam wytracania osadu.

Wnioski: Próba biuretowa dala pozytywny wynik na obecność białek w roztworze, świadczy o tym kolor próbki.

Brak osadu w reakcji z TCA świadczy o całkowitym wysoleniu białka z roztworu.

2.2. BIALKA JAKO KOLOIDY

Białka ze względu na swój duży rozmiar, a także ze względu na obecność grup hydrofilowych, tworzą roztwory zaliczane do właściwych układów koloidalnych, zwanych również koloidami hydrofilowymi. Białka rozpuszczając się w środowisku wodnym, tworzą w okol siebie tzw. otoczkę hydratacyjna. Polega to na grupowaniu na hydrofilowych obszarach swoich cząsteczek dipolarnych molekuł wody.

Sposób wykonania:

Do dwóch probówek nr 1 i nr 2 odmierzyłam po 1 ml 0,01M roztworu AgNO₃.

Do próbówki nr 1 dodałam 1 ml roztworu białka jaja kurzego, natomiast do próbówki nr 2

1 ml wody. Obie próby wymieszałam i do każdej dodałam odrobinę NaCl.

Obserwacje: W probówce nr 1 po dodaniu białka roztwór uległ wyraźnemu zmętnieniu.

W probówce nr 2 po dodaniu wody nie zaobserwowałam żadnych zmian.

Po dodaniu NaCl w probówce nr 1 osad się całkowicie rozpuścił natomiast w probówce nr 2 zaobserwowałam zmętnienie.

Wnioski: W probówce nr 1 doszło do zmętnienia po dodaniu roztworu białka. Dzieje się tak na skutek tego, iż AgNO₃ jest związkiem hydrofobowym, natomiast białko jest koloidem hydrofilowym. Dzięki temu pełni ono role swoistego stabilizatora. Otacza ono hydrofobowe cząsteczki narzucając im hydrofilowy charakter. Stad obserwujemy zmętnienie roztworu. Dodanie NaCl spowodowało rozpuszczenie osadu.

W probówce nr 2 po dodaniu NaCl wytrącił się osad AgCl.

2.3. AMFOTERYCZNOSC BIALEK

Białka sa związkami amfoterycznymi. Oznacza to, ze molekuły białek maja charakter wielowartościowego jonu. Przy pH=Pi (punkt izoelektryczny) cząstki białka osiągają stan zobojętnienia. Punkt izoelektryczny jest wartością charakterystyczna dla danego białka.

W pH<pI cząstki białka maja charakter polikationowego kwasu a w pH>pI polianionowej zasady.

1. Strącanie białek za pomocą kationów i anionów.

Sposób wykonania:

Do trzech probówek odmierzyłam po 2 ml roztworu bialka jaja kurzego o pH wynoszącym kolejno 8,0; 4,7 i 3,0. Następnie kolejno do każdej dodawałam kroplami niżej wymienione roztwory soli.

Obserwacje:

Tabela nr 1 „Strącanie białek za pomocą kationów i anionów”

Odczynnik	1% roztwór jajka kurzego
		pH=8,0	pH=4,7	pH=3,0
10% siarczan miedziowy	+	-	-
10% octan ołowiu (II)	+	-	-
10% wolframian sodowy	-	+-	+

Opis: „+”- powstał białczan; „-”, „+-”- brak osadu soli

Wnioski: Przy pH=8,0 białka sa w formie polianionu. Świadczy o tym osad, jaki wytrącił się po dodaniu dwóch pierwszych związków, tj. siarczynu miedziowego i octanu ołowiu (II). Metale tych związków, po zdysocjowaniu sa kationami. Osad świadczy o tym, iż połączyły się one z białkami, a zatem cząstki białka musiały mieć charakter anionów.

Stad tez obserwujemy brak osadu przy pH=4,7 gdzie mamy do czynienia z tzw. amfijonem, czyli cząstki białka osiągnęły stan zobojętnienia. W przypadku pH=3,0 białka maja charakter polikationu a zatem nie reaguja z kationami metali, co jest powodem niewytracenia osadu.

Inna sytuacje mamy w przypadku roztworu wolframianu sodu, gdzie po dysocjacji jon metalu jest anionem. Przy pH=8,0 i 4,7 nie obserwujemy wytracania osadu (lekkie zmętnienie wystąpiło w probie z pH=4,7 jednak byo to spowodowane tym, iż w probce ilość białkowych polikationow i polianionow była bardzo zbliżona). W przypadku próby o pH=3,0 widzimy wyrazny osad. W tym przypadku białkowe polikationy łącza się z anionami dysocjowanego metalu.

Tak powstałe produkty maja charakter soli i nazywamy je białczanami.

2. Wpływ kwasów organicznych na białka.

Sposób wykonania:

Do trzech probowek odmierzyłam po 1 ml 1% roztworu białka kurzego, a następnie dodałam po 1 ml odpowiednich kwasów organicznych, podanych poniżej.

Obserwacje:

Tabela nr 2 „Wpływ kwasów organicznych na białka”

KWAS	OBSERWACJE
6% kwas sulfosalicylowy	+
10% kwas trojchloooctowy	+
5% kwas octowy	-

Opis: „+”- osad się wytrącił; „-”- brak osadu

Wnioski: Kwas sulfosalicylowy ma silnie elektroujemna grupę sulfonowa, dzięki temu jest to mocny kwas, co oznacza, ze całkowicie dysocjuje na jony. Podobnie jest z kwasem trojchlorooctwym- jest mocny gdyż zawiera trzy silnie elektroujemne atomy Cl. Kwasy te sa mocnymi kwasami organicznymi i powodują denaturacje białek. Tworzą z nimi trwale, nierozpuszczalne połączenia. Dlatego w pierwszych dwóch przypadkach widzimy wyraźny osad. Ponadto możemy stwierdzić, ze im mocniejszy kwas tym intensywniejszy osad się wytraca. W przypadku trzeciego kwasu osad się nie wytrącił, gdyż kwas octowy jest kwasem słabym. Nie denaturuje on białek i nie tworzy z nimi połączeń.

2.4. DENATURACJA CIEPLNA

Denaturacja to proces w wyniku którego następuje trwała destrukcja konformacji białka, w wyniku której dochodzi zmian fizykochemicznych właściwości oraz utraty jego naturalnej funkcji biologicznej.

Może być ona spowodowana zarówno czynnikami fizycznymi, jak np. zbyt wysoka lub zbyt niska temperatura, promieniowanie UV, wysokie ciśnienie, itp., jak i czynnikami chemicznymi, np. pod wpływem stężonych kwasow lub zasad; jonów metali ciężkich.

Jest to proces nieodwracalny.

W szczególnych warunkach, czyli przy pH=pI, denaturacja cieplna prowadzi do koagulacji, co przedstawia poniższe ćwiczenie.

Sposób wykonania:

Do trzech probówek odmierzyłam po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH, przedstawionym niżej. Próby umieściłam na 15 min we wrzącej łaźni wodnej. Następnie schłodziłam je i dodałam po 5 ml 0,1M buforu octanowego o pH=4,7 do próbek zawierających białko o pH= 3,0 oraz 8,0.

Obserwacje: w probówce z białkiem o pH=8,0 po ogrzaniu wytrącił się lekki osad. Po dodaniu buforu octanowego roztwór stal się mleczny.

Przy pH=4,7 po ogrzaniu wytrącił się duży, zbity osad.

Przy pH=3,0 z kolei po ogrzaniu nie wytrącił się osad natomiast po dodaniu buforu osad był delikatny.

Wnioski: W probówce z białkiem o pH=4,7 denaturacja cieplna doprowadziła do koagulacji. Wiemy, ze dzieje się tak, gdy pH białka jest równe jego pI. Koagulacja to daleko posunięta nieodwracalna agregacja rozwiniętych łańcuchów peptydowych. Agregat taki jest nierozpuszczalny. Jest to proces nieodwracalny. W pozostałych probówkach doszło do lekkiego zmętnienia, jednak nie jest to pewna oznaka denaturacji białka, gdyż w procesie denaturacji białko nie zawsze zostanie wytracone.

2.5. METODY OZNACZANIA BIALKA

Ostatnia częścią doświadczenia było zapoznanie się z metodami oznaczania białka. Polegają one na wykorzystaniu obecności w cząsteczkach białek min. Wiązań peptydowych, aminokwasów aromatycznych czy zdolności białek do wiązania danego barwnika. Najczulsza metoda oznaczenia białek jest kolorymetryczna metoda Lowry`ego. Stanowi ona połączenie reakcji biuretowej i reakcji obecnych w białkach reszt aminokwasów aromatycznych z odczynnikiem Folinaciocletu.

Na laboratorium stosowaliśmy tzw. reakcje biuretowa. Na jej podstawie możemy stwierdzić obecność białka w badanym roztworze.

Sposób wykonania:

Do 2 ml badanego roztworu białka dodałam 2 ml 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 1% roztworu CuSO₄. W tym samym czasie według podanego schematu przeprowadziłam próbę dla wody.

Obserwacje: Roztwór białka w reakcji tej przybrał barwe fioletowo-niebieska.

Woda zabarwiła się na jaskrawo niebieski kolor.

Wnioski: W wyniku reakcji z białkiem utworzył się dwubarwny układ. Metoda ta pozwala tylko na stwierdzenie obecności białka w roztworze. Nie określa za to jego rodzaju.

3. Podsumowanie i wnioski

Celem tego ćwiczenia było przybliżenie nam właściwości fizycznych i chemicznych różnych białek. Wiemy, ze niezależnie od pochodzenia i funkcji maja one szereg wspólnych cech, jednak biorąc pod uwagę strukturę chemiczna bądź tez właściwości fizyczne widzimy jak bardzo mogą się one od siebie różnić.

W pierwszej części badaliśmy rozpuszczalność i wysalanie białek. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń doszliśmy do kilku ważnych wniosków: pierwszym jest to jak istotna role pełni dobranie odpowiedniego rozpuszczalnika w procesie ekstrahowania białek. Źle dobrany rozpuszczalnik nie rozpuści wszystkich białek, co może zadecydować o niepowodzeniu procesu. Druga ważną obserwacja jest to, iż różne białka rozpuszczają się w inny sposób. Potwierdziliśmy to na przykładzie albumin i globulin, gdzie te pierwsze rozpuszczają się tylko w wodzie natomiast te drugie potrzebują już do rozpuszczenia roztworu soli. Takie rozpuszczanie globulin nosi nazwę wsalania.

W kolejnym doświadczeniu z kolei badaliśmy zjawisko wysalania, czyli dehydratacji cząstek białka. Badanie przeprowadziliśmy na 1% roztworze białka jaja kurzego.

Brak kryształków w ostatniej próbie świadczy o całkowitym wysoleniu białka.

A zatem możemy powiedzieć, iż badane białko miało stosunkowo słabe powinowactwo do wody. Świadczy o tym niskie stężenie użytego kwasu. Ponadto wiemy, ze proces ten jest odwracalny i nie niszczy struktury ani naturalnych funkcji białka.

Kolejna badana cecha była koloidalność białek. Jest to cecha wszystkich białek. W przeprowadzonym doświadczeniu zaobserwowalismy zmętnienie roztworu białka po dodaniu azotanu srebra. Tak jak wyżej zostało wyjaśnione stało się tak, gdyż Białką maja charakter hydrofilowy i staja się swoistymi stabilizatorami dla cząstek hydrofobowych.

Następnym etapem było zapoznanie się z amfoterycznym charakterem białek. Jak widzimy w tabeli nr 1, w zależności od pH, białka przyjmowały kolejno charakter polianionu, amfijonu oraz polikationu. Miało to wpływ na wytracanie osadu. W przypadku pierwszych dwóch związków osad wytrącił się w pH=8,0 gdyż białkowe polianiony łączyły się z kationami metali. W trzecim przypadku mieliśmy do czynienia z anionem wolfraniowym, dlatego osad wytrącił się przy pH=3,0 a nie tak jak w poprzednich przypadkach w pH=8, gdyż w niższym pH białka przybierały charakter polikationow.

Po tym doświadczeniu zbadaliśmy wpływ kwasów organicznych na białka. Na podstawie tabelki widzimy, iż osad wytrącił się tylko w reakcji z kwasami mocnymi, czyli z kwasem sulfosalicylowym oraz kwasem trojchlorooctowym. W tych przypadkach doszło do denaturacji białek i utworzenia z nimi trwałego połączenia. W przypadku kwasu słabego, jakim był kwas octowy wytracenie nie zaszło.

Ostatnim badanym zjawiskiem była denaturacja białek. Polega ona na niszczeniu struktury łańcucha białka, co prowadzi do jego trwałych zmian fizykochemicznych. Denaturacja może być fizyczna bądź chemiczna. W naszym doświadczeniu badaliśmy ta pierwsza możliwość. Czynnikiem fizycznym w tym przypadku była wysoka temperatura.

Na podstawie tego zadania dowiedliśmy, iż w pH=pI może dojść do tzw. koagulacji, czyli nieodwracalnej agregacji. Zlep taki jest całkowicie nierozpuszczalny. Ponadto upewniliśmy się, iż denaturacja białka nie jest równoznaczna z jego wytraceniem z roztworu.

Podczas wszystkich oznaczeń stosowaliśmy tzw. metodę biuretowa. Pozwala ona na wykrycie białka w roztworze, nie mówi jednak z jakim białkiem mamy do czynienia.

10

---