Biotechnologia 3

IZOLOWANE MERYSTEMY

Kultura in vitro izolowanych merystemów

1. Kultury merystemów otrzymuje się po precyzyjnej izolacji merystemów pod binokularem (minimum 20x powiększenie) ze sterylnego wierzchołka pędu

2. Eksplantat rozwija się szybko, pasażowany co 3-4 tygodnie na świeżą pożywkę (MS + witaminy + cukier + kompleks auksyna/cytokinina)

Dwubiegunowość strukturalna zarysowuje się po 14 dniach izolacji.

3. Po upływie 20 dni następuje rozwój zarodka nowego liścia

4. Po 2 miesiącach otrzymujemy roślinę gotową do przeniesienia na podłoże glebowe. Duże znaczenie ma przygotowanie roślin do ukorzeniania in vitro tj. pasaż na pożywkę o zmniejszonej zawartości auksyny, zmniejszonej zawartości związków mineralnych oraz bez sacharozy. Zabieg ten ułatwia rośliną podjęcie fotosyntezy i powrót do samożywności.

5. Roślinom wysadzonym do odkażonego termicznie podłoża glebowego początkowo gwarantuje się wysoką wilgotność (częste zraszanie i umiarkowane wietrzenie). Adaptacja obejmuje stopniowe uodpornienie na stresy związane z wilgotnością, temperaturą i natężeniem światła.

6. Po przeprowadzeniu pierwszego testowania i wyeliminowania roślin podejrzanych o zawirusowanie otrzymujemy elitarny matecznik, który chroni przed wtórnym zainfekowaniem, poddając go regularnym kontrolą fitosanitarnymi

Alternatywne sposoby prowadzenia kultur merystemów:

1. Wielokrotny podział roślin, które rozwinęły się z merystemów na „sadzonki węzłowe”

• Metoda przydatna na wielkotowarowym systemie uprawowym roślin ozdobnych, sadowniczych oraz Asparagus officinalis (szparag) i Solanum tuberosum. Zapewnia ciągłą produkcję mikrosadzonek identycznych z genoty6pem rośliny matecznej.

• Szczególną odmianą tej metody jest indukowanie genów spichrzowych (np. mikroulwek lub mikrokłączy)

2. Pobudzanie pojedynczego merystemu do podziału:

• Proliferencja tkanki merystematycznej, w której powstają liczne paki i pędy na drodze organogenezy bezpośredniej.

• Duże wierzchołki pędów (merystem wierzchołkowy, zawiązki liści i pachwinowo usytuowane paki boczne) wykłada się na pożywkę z dodatkiem cytokinin o wysokim stężeniu; powoduje rozwój tzw. wieloroślinek. Ponowne pasaże wieloroślinek gwarantuje w krótkim czasie uzyskanie tysięcy roślin potomnych.

• Wykorzystywane do produkcji m.in. Dianthus Chrysanteum

3. W ramach techniko obiecująca jest metoda „powielania” lub „rozszerzania” merystemów

• Praktykuje się wykładanie na pożywkę zawierającą retardanty (paklobutanazol, diaminozja, etylen lub etafon)

• W efekcie merystem powiększa się 5-6 razy ,po czym może być powtórnie podzielony i po kolejnych subkulturach przeniesiony na pożywkę bez substancji wzrostowych na której z każdego eksplantatu rozwijają się rośliny.

4. Proliferencja tkanki merystematycznej drogą regeneracji, czyli organogenezy pośredniej → przez stadium kalusa → rozwijają się w paki i pędy

• Izolowane merystemy wykładane są na pożywki z dużym dodatkiem auksyn poprzez co uzyskuje się efekt namnażania kalusa. W tkance kalusa pojawiają się centra merystematycznej, z których dopiero rozwijają się masowo pędy i rośliny.

• Wadą tej metody jest duża tendencja do zmienności somatycznej

Kultura pędów bocznych (pachwinowych)

Inicjalnymi eksplantatami w tej metodzie mikrorozmnażania wegetatywnego mogą być:

• Paki kątowe (boczne)

• Fragmenty pędów z węzłem, pachą liści i paków bocznych

• Wierzchołki pędów mogą być izolowane z zarodków somatycznych

Procedura postępowania:

• Po wyłożeniu a pożywkę nie zawierającą substancji wzrostowych , pąki zazwyczaj nie krzewią się i rozwijają w pojedynczą roślinę. Pożywki z dodatkiem cytokinin redukują hamujące działanie auksyny (znoszą dominację wierzchołkową) co umożliwia szybkie namnażanie pędów (proliferencja) i tworzenie nowych roślin

• Uorzenienie namnożonych pędów zachodzi na pożywkach z dodatkiem auksyny i innych kofaktorów ukorzeniania takich jak: fenole, etylen, retardanty, poliamidy

Tępo mikrorozmnażania

1 roślina mateczna daje 3 krotny wzrost co 4 tygodnie

Lub 6 krotny wzrost co 6 tygodni

↓

Milion roślin potomnych rocznie

Przykłady:

• Winorośl 3 mln ukorzenionych sztuk

• Gerbera 1 mln

• Ziemniak 2 mln

• Cebula 8-60 tys pędów

Za pomocą tej metody rutynowo namnaża się wiele gatunków roślin: gerbera, Spatiphyllum, Nephroleptis oraz Orchidaceae

Kultury primordiów pędowych:

1. zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 2-3 zawiązkami (primordia) liściowymi

umieszczenie ich na pożywkach płynnych, ważne:

• skład pożywki

• cyrkulacja

• objętość płynu, tkanki

• temperatura

• intensywność naświetlania !!!

• częstotliwość pasaży

2. po wstępnym okresie stabilizacji - intensywne namnażanie primordiów pędowych, które tworzą zielone chlorofilowe agregaty

3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny → ukorzenianie → regeneracja rośliny

Metoda znalazła zastosowanie w masowej regeneracji gatunków roślin 1- i 2-liściennych oraz drzewiastych. Ma bardzo duży współczynnik namnażania.

Produkcja roślin in vitro na świecie:

Rozmnażanie wegetatywne roślin in vitroznalazło zastosowanie przede wszystkim w produkcji takich roślin, które trudno rozmnażają się za pomoca tradycyjnych metod in vitro (rośliny ozdobne, drzewa leśne, podmiany heterozygotyczne) oraz roślin elitarnych , o dużej wartości jednostkowej.

• Ameryka Północna - 100 komercyjnych laboratoriów

52 z nich produkuje 15-20 mln sztuk

8-10 laboratoriów 2-10 mln sztuk

Pozostałe ok. 1 mln sztuk rocznie

• Europa zachodnia 248 laboratoriów komercyjnych

37 z nich produkuje ponad 1 mln rocznie

• Produkcja europejska wynosi 200 mln sztuk roślin rocznie z czego najwięcej stanowią ozdobne rośliny doniczkowe

• Największym producentem w Europie jest Holandia (62 mln sztuk) następnie: Francja, Polska, Niemcy, Włosi i Belgowie

• Czołowi producenci na świecie: USA (110 mln sztuk) oraz Indie (130 mln sztuk)

Namnażane rośliny:

1. ozdobne doniczkowe - fiołki afrykańskie, fikusy, anturia

2. ozdobne cięte - anturia, chryzantemy, frezje gerbery, goździki

3. sadowniczych - ananasy, banany, brzoskwinie, cytryny

4. uprawnych - trzcina cukrowa, bataty, ziemniaki

5. warzywnych i przyprawowych - kalafior, czosnek, sałata, brokuły, wanilia, kardamon

6. mięsożernych - tłustosze, rosiczka

MIKROROZMNAŻANIE ROSLIN DRZEWIASTYCH

Forma dojrzała ≠forma juwenalna (młodociana)

Zdrewniała → zielna

Rejuwenalizacja → „odmłodzenie”, stymulacja wigoru

AKLIMATYZACJA ROSLIN

In vitro → in vivo

Czynniki stresogenne (in vivo):

• zasadniczo niższa wilgotność pomieszczenia

• wyższe natężenie światła

• brak aseptyczności

Morfologia i fizjologia aklimatyzowanych roślin:

1. kutikula pozbawiona woski, brak ochrony przed transpiracją

2. nie funkcjonują aparaty szparkowe

3. asymilacja CO₂ bardzo niska. Czasami bilans ujemny

4. zawartość chlorofilu spada

5. często eksplantaty nie są ukorzenione stąd dodatkowo problem inicjacji rizogenezy

Okres fotosyntetycznej aklimatyzacji trwa 4 tygodnie

Ukorzenianie

Stanowi 35-75% wszystkich kosztów mikrorozmnażania

Jest to:

• cecha gatunkowa

• dopuszczalne traktowanie regulatorami wzrostu (ex vitro), np. IBA, NAA

• istotna wielkość eksplantatu

• rodzaj podłoża (mineralne)

Przygotowanie do samodzielnego wzrostu

In vitro

↓

Pożywka ukorzeniająca

↓

Po właściwym ukorzenieniu

↓

Uchylić zamknięcia naczyń, usunąć agar, dodać fungicydy

Ex vitro

↓

Ukorzenianie poza szkłem (substancja stymulująca ukorzenianie)

↓

Umieszczenie w stałym podłożu (podłoże mineralne, gleba)

Czynniki korzystne:

• wysoka wilgotność (zamgławianie, zraszanie)

• cieniowanie

• właściwy fotopriod

• ogrzewanie podłoży

↓

Po rozwinięciu nowych liści:

• wyłączenie ogrzewania

• stopniowa redukcja wilgotności

Podłoże mineralne, np. Verniculit, pianka poliuretanowa, perlit, wełna mineralna

Zalety:

• sterylne, wolne od patogenów

• ułatwia ukorzenianie dzięki specjalnej strukturze porowato-fibrynalnej

• nie zawiera substancji odżywczych, tj. zanieczyszczeń organicznych

• sprasowanie w bryłach lub kostkach ułatwia transport roślin

• gwarantuje dogodną migrację i dyfuzję gazów

• zapewnia optymalną dystrybucję H₂O

Przed użyciem podłoże należy nasycić rozcieńczoną pożywką lub dodać hormony

Warunki fotoautotroficzne:

• wysokie natężenie światla

min. 100 nmd m^-2s^-1 (ok. 7,7 klux)

PAR 400-700 nm

(konwencjonalne hodowle)

≈ 30-50 nmd m^-2s^-1 (ok. 2,5-3,9 klux)

• wysokie stężenie CO₂

≥ 350 ppm, potem co 5 dni zwiększyć dawkę CO₂ o 500 ppm

Zalety kultury autotroficznej:

• namnażanie roślin 2x szybsze

• można zredukować lub wyeliminować substancje wzrostowe

• spada wilgotność poniżej 100%, co hamuje m.in. syntezę etylenu, poprawia wigor roślin, normalnie funkcjonują aparaty szparkowe

• przy braku cukru spada procent infekcji bakteryjnych i grzybowych

• można prowadzić hodowlę w dużych pojemnikach - spadek kosztów

• łatwa aklimatyzacja roślin przy wsadzeniu do gruntu

Korzyści z klonowanie in vitro:

• mikrorozmnażanie może być kontynuowane przez cały rok, tj. bez względu na porę roku

• klonowanie umożliwia powrót do formy juwenilnej (istotne przy namnażaniu form krzewiastych i drzew)

• ułatwia prace hodowlane (pozyskiwanie nowych odmian, skracanie cyklu hodowlanego, namnażanie genotypów niestabilnych - chimer)

• zastępuje szczepienie lub okulizację

• umożliwia przechowywanie ogromnej ilości materiału namnożeniowego na stosunkowo małej powierzchni

• umożliwia fitosaniterne przemieszczanie się roślin między różnymi krajami

• dostarcza materiał wolny mikroograniczych i patogenicznych zanieczyszczeń

• przy właściwym doborze metody klonowania obniża koszty produkcji roślin (w stosunku do tradycyjnych metod namnażania in vitro)

• gwarantuje stabilność genetyczną

Kultury protoplastów:

• stanowią unikalna populacje jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie

• każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo, tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością

• protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących organogenezę oraz w badaniach mutacyjnych

Wykorzystanie protoplastów:

Jako system jednokomórkowy, pozbawiony ścian komórkowych , zdolny do ich odtwarzania, służący do badania szeregu procesów zachodzących na poziomie:

• biosyntezy ścian komórkowych

• badania właściwości plazmalemmy, składu błon, ładunku, receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego pobierania i transportu związków dorbonocząsteczkowych

• funkcjonowania organelli (łatwość ich izolacji)

• badanie czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe czynniki metaboliczne

• wpływ hormonów na morfogenezę

• źródło pozyskania mieszańców somatycznych !!!

• doskonały materiał do biotransformacji !!!

Pozyskiwanie protoplastów:

• fragment tkanki, np. liści poddajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę

• skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową (istotny w czasie inkulacji) temperatura, pH, światło i wytrząsanie

• degradacja dwuetapowa - najpierw działają enzymy pektyno- a następnie celuolityczne

• degradacja jednoetapowa - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany (pektyny, hemicelulozę i celulozę)

• ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych (o charakterze jonowym i niejonowym)

• mieszaninę filtrujemy przez sita

• delikatnie wirujemy

• w zależności od zastosowanego stabilizatora frakcje protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu lub ewentualnie między fazami przy zastosowanym gradiencie nieciągłym

• przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką

• ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie żywotności

Fuzja protoplastów:

Zlanie protoplastów ułatwiają tzw. stymulatory, które mogą być różnego pochodzenia:

• Natury fizycznej: wirowanie, impulsy elektryczne, elektroforeza

• Natury chemicznej: glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy, lektyny, wysokie stężenie jonów wapnia w silnie alkaicznym pH

Somatyczna hybrydyzacja protoplastów

Fuzja protoplastów

↓

Selekcja heterokariocytów

↓

Hodowla mieszańców

(krzyżowanie wsteczne)

↓

Pełna regeneracja rośliny

(nowa jakość)

Selekcja heterokariocytów:

Do czynników identyfikujących ich selekcjonujących heterokarioniny należą:

• Barwienie różnymi barwnikami ”przyżyciowymi”

• Okresowe stosowanie różnych inhibitorów metabolizmu

• Analiza izoenzymatyczna

• Stosowanie różnych markerów cytochemicznych i molekularnych

---