18.02.2005 - Ćwiczenia 1

TEMAT: Przygotowanie komórek i tkanek do badań mikroskopowych.

Jak przygotować preparat?

1. Pobieramy wycinek tkanki odpowiedniej wielkości i grubości

2. Utrwalamy tkankę.

3. Odwodnienie tkanki

4. Prześwietlenie tkanki

5. Zatopienie w parafinie

6. Zrobienie bloczka

7. Skrawanie bloczka

8. Nakładanie skrawków na szkiełko

9. Rozprostowanie skrawków

10. Suszenie preparatu

11. Barwienie

Utrwalenie tkanki

Utrwalamy przeprowadzając jak najszybszą denaturację białek. Ochraniamy tym samym komórkę przez lizą enzymami proteolitycznymi. W tym procesie zostają zachowane tłuszcze i procesy fizjologiczne. Aby pozbyć się tłuszczy musimy zastosować rozpuszczalnik organiczny.

Utrwalacze mogą być:

• chemiczne

• proste

• złożone

• fizyczne

Proste utrwalacze chemiczne działają jako substancja odwadniająca i w ten sposób wytrącane są białka:

1. substancje organiczne: aceton, alkohole

2. substancje tworzące z białkami sole: sublimat (HgCl₂), dwuchromian potasu (K₂Cr₂O₇), kwas pikrynowy. Wadą tych utrwalaczy jest fakt, że tkanki na które nimi działamy bardzo twardnieją. Wykorzystuje się je jako składnik utrwalaczy złożonych.

3. kwasy: octowy, sulfosalicylowy, chromowy, trichlorooctowy. Obniżają one pH środowiska i zmieniają w ten sposób uwodnienie tkanek. Tkanki przechodzą w żel i wytrącają się białka

4. związki tworzące z białkami tzw. mostki: formalina. Tworzy ona mostki metylowe i wytrąca białko. Doprowadza ta metoda do nadmiernego utwardzenia tkanek, które zależy od C_m, czasu utrwalania i rodzaju takanki

Złożone utrwalacze chemiczne to mieszaniny (koktajle) różnych utrwalaczy prostych, których cechy pozytywne wykorzystuje się, a cechy negatywne stara się wyeliminować: płyn Buena, płyn Carnua (kw.pikrynowy)

Utrwalacze fizyczne: stosuje się niską temperaturę. Wyróżniamy dwa procesy:

I) zamrażanie - proces przebiegający powoli. Powstające kryształki lodu są bardzo duże co prowadzi do mechanicznego rozrywania tkanek. Wykorzystuje się przy szybkiej diagnostyce histopatologicznej. Tzw. skrawki kriostatowe( skrawki powstające nie przez zamrażanie to skrawki parafinowe)

II) liofilizacja - proces przebiegający bardzo szybko w warunkach próżniowych i przy obniżonym ciśnieniu. Najczęściej w ciekłym azocie. Zachodzi sublimacja wody i powstające kryształki lodu są mniejsze niż w czasie zwykłego zamrażanie i straty są mniejsze.

Odwodnienie

Odwodnienie przeprowadza się w szeregu alkoholowym. Przekładamy materiał do pojemników ze stopniowo zwiększającym się C_p alkoholu - od 50 - 99,8 %. W czasie tego procesu woda w preparacie zostaje zastąpiona alkoholem.

Prześwietlenie i zatopienie w parafinie

Dalej zastępujemy alkohol parafiną. Ten proces to tzw. prześwietlanie tkanki. Używamy w tym celu roztworów rozpuszczalnych w C₂H₅OH i takich w których rozpuszcza się parafina. Są to m.in.: ksylen, benzen, toluen. Następnie skrawki przesycone np. ksylenem umieszcza się w ogrzanej, ciekłej parafinie, która przenika do komórek skrawka. Proces ten zachodzi w cieplarce utrzymującej temp topnienia parafiny (około 50^oC)

Zrobienie bloczka i skrawanie

Przesycony parafiną skrawek wkładamy do specjalnej foremki wypełnionej ciekła parafiną. Następnie schładza się tą formę, parafina się łączy i powstaje tzw. bloczek parafinowy. Umieszczamy go nieruchomo w urządzeniu do skrawania - mikrotomie. Wyróżniamy mikrotomy: korbowe (nóż pozostaje w pozycji stałej a ruchomy jest bloczek) oraz saneczkowe (nóż jest w ruchu a bloczek stały). Skrawamy bloczek na skrawki grubości kilku do kilkunastu mikrometrów.

Nakładanie na szkiełko i rozprostowywanie i suszenie

Przenosimy małe skrawki na szkiełko podstawowe. Musimy je jednak rozprostować, ponieważ w czasie skrawania pozaginały się. Możemy to zrobić na dwa sposoby: albo powrzucać skrawki do ciepłej wody i wyławiać je bezpośrednio na szkiełko podstawowe albo nałożyć pofałdowany skrawek na szkiełko i nakropić wodę i delikatnie ogrzać. Nastąpi rozprostowanie skrawka. Następnie suszymy skrawek na szkiełku. Aby lepiej do niego przylegał, smarujemy prędzej szkiełko cienką warstwą białka kurzego.

Barwienie

Najczęściej barwimy metodą hematoksyliny i eozyny. Są to barwniki wodne. Hematoksylina to barwnik zasadowy. Barwi struktury zasadochłonne (jądro) na niebiesko. Eozyna to barwnik kwasowy, zwany cytoplazmatycznym. barwi struktury posiadające reszty aminowe: białka cytoplazmatyczne na czerwono.

Aby zabarwić preparat:

1. odparafinowywujemy skrawek

2. nawadniamy skrawek przez przejście odwrotnego szeregu alkoholi od 99,8 do 50 % (zastępujemy parafinę wodą)

3. barwimy jądro hematoksyliną

4. Po dobrym wybarwieniu płuczemy w bieżącej wodzie - tzw. bejcowanie. Wypłukujemy tym samym nadmiar hematoksyliny

5. Barwimy eozyną

6. Odwadniamy skrawki w szeregu alkoholowym

7. Prześwietlamy preparat w ksylenie, byśmy mogli zamknąć go szkiełkiem. Robimy to po zatopieniu w balsamie kanadyjskim.

8. Suszymy preparat w cieplarce.

PREPARATY: móżdżek, nerka, skóra owłosiona barwiona AZAN

1

---