Ćwiczenie 12

Metody wprowadzania DNA do komórek bakteryjnych (transformacja, koniugacja trójrodzicielska, elektroporacja).

Transformacją nazywamy proces pobierania egzogennego DNA przez komórkę biorcy. Zjawisko naturalnej transformacji jest częste w przypadku bakterii rosnących w strukturze biofilmu, a w regulacji tego procesu znaczącą rolę odgrywa zjawisko wyczuwania liczebności (ang. quorum sensing). Transformacja u większości bakterii wymaga zastosowania specyficznych metod laboratoryjnych. Jedynie komórki znajdujące się w stanie tzw. kompetencji są zdolne do pobrania DNA ze środowiska. Niektóre rodzaje bakterii osiągają stan kompetencji spontanicznie np. Bacillus, Streptococcus, Azotobacter czy Helicobacter, bądź też są w stanie konstytutywnej kompetencji jak Neisseria gonorrhoeae. Bakterie są zdolne do pobrania każdego DNA, jedynie w przypadku N. gonorrhoeae i H. pylori wymagana jest homologia sekwencji do chromosomowego DNA.
W warunkach laboratoryjnych transformację chemiczną przeprowadza się dodając mieszaninę DNA do zawiesiny komórek uprzednio traktowanych czynnikami chemicznymi w niskiej temperaturze. Całość poddaje się szokowi termicznemu, a po odpowiednim czasie inkubacji wysiewa na podłoża selekcyjne. Odmianą transformacji jest elektrotransformacja (elektroporacja) wykorzystywana w przypadku bakterii, które nie uzyskują stanu kompetencji pod wpływem czynników chemicznych lub gdy wydajność procesu transformacji jest niska. W tej metodzie mieszaninę DNA i bakterii poddaje się krótkiemu (5 -10 msec) pulsowi prądu elektrycznego o napięciu rzędu 2,5 kV.
Wydajność transformacji w przypadku E. coli zależy od formy DNA: najwyższa dla formy CCC, niższa dla OC a najniższa dla formy liniowej. Do komórki bakterii wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, o czym warto pamiętać w przypadku przeprowadzania transformacji mieszaniną różnych cząsteczek DNA.

Koniugacja jest definiowana jako proces przekazywania materiału genetycznego z jednej komórki bakteryjnej do drugiej, wymagający bezpośredniego kontaktu obu komórek. Transfer koniugacyjny plazmidów jest zaliczany do najistotniejszych procesów HGT (ang. horizontal gene transfer). Proces koniugacji można podzielić na dwa etapy:

• przygotowanie DNA plazmidu do transferu koniugacyjnego tzw. funkcje Dtr (ang. DNA transfer and replication)

• powstanie tzw. „mostu koniugacyjnego” czyli fuzji błon miedzy dawcą

a biorcą u bakterii gramujemnych a w przypadku bakterii gramdodatnich tworzenie agregatów koniugacyjnych, tzw. funkcje Mpf (ang. mating pair formation).
DNA jest przekazywany jednokierunkowo w postaci jednoniciowego odcinka DNA dawcy o polarności 5'→3'. Powstały na skutek przecięcia nici wolny koniec 5' pozostaje przytwierdzony do błony komórkowej w pobliżu połączenia partnerów. Do biorcy wprowadzana jest tylko jedna nić DNA (ta, która ulega przecięciu), stanowi ona matrycę do syntezy nici komplementarnej, czego efektem jest odtworzenie plazmidu w komórce biorcy. Wolny koniec 3'-OH stanowi starter do syntezy komplementarnej nici w komórce dawcy wg modelu RC.

Plazmid koniugacyjny (Tra+ Mob-) - plazmid zawierający w obrębie swojej cząsteczki zespół genów warunkujących kompletny proces koniugacji. Duże rozmiary (kilkadziesiąt kb) plazmidów koniugacyjnych utrudniają ich stosowanie jako wektorów.

Plazmid mobilizowalny (Tra- Mob+) - plazmid pozbawiony genów transferu, ale możliwe jest jego przeniesienie do komórki biorcy w obecności innego plazmidu koniugacyjnego tzw. plazmidu mobilizującego (syn. plazmid pomocniczy; ang. helper).
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek dwóch gatunków bakterii: E. coli DH5α na drodze transformacji i elektroporacji R. leguminosarum bv. viciae na drodze koniugacji.

Materiały:

1. Elektroporacja:

• płynna hodowla E. coli DH5α w podłożu LB (OD₅₅₀ = 0,4 - 0,6);

• podłoże płynne LB, płytki ze stałym podłożem LB z dodatkiem ampicyliny, preparat plazmidowy pGEM, zimna jałowa woda, zimny jałowy 10% glicerol, lód, alkohol skażony do jałowienia;

• kuwety do elektroporacji, pulser do elektroporacji, wirówka z chłodzeniem, jałowe probówki, ciekły azot, pipety automatyczne, końcówki do pipet, głaszczka.

2. Transformacja:

• nocna płynna hodowla E. coli DH5α;

• 2x st. bufor TSS (20% PEG, 100 mM MgCl₂, 20 ml podłoża LB), DMSO, płynne podłoże LB, płytki ze stałym podłożem LB z dodatkiem ampicyliny, preparat plazmidowy pUC19, alkohol do jałowienia;

• szklane gilzy wirówkowe, wirówka z chłodzeniem, jałowe probówki, ciekły azot, lód, pipety automatyczne, końcówki do pipet, głaszczka.

3. Koniugacja trójrodzicielska:

• hodowla płynna R. leguminosarum bv. viciae (Rifr) w podłożu TY - biorca;

• hodowla płynna E. coli pMPA221 (Tc^r) w podłożu LB - dawca;

• hodowla płynna E. coli pRK2030 (Km^r) w podłożu LB - helper;

• płytki ze stałym podłożem 79CA oraz 79CA z dodatkiem rifampicyny i tetracykliny, woda jałowa, alkohol skażony do jałowienia;

• jałowe probówki, pipety automatyczne, końcówki do pipet, wirówka, głaszczka.

Wykonanie:

1. Elektroporacja:

• płynną hodowlę E. coli DH5α chłodzić w lodzie przez 30 minut;

• schłodzone hodowle odwirować (10 minut przy 9 tys. obr/min w temperaturze 4°C);

• usunąć supernatant przy pomocy pompki wodnej, a następnie zawiesić komórki w zimnej wodzie;

• komórki odwirować (10 minut przy 9 tys. obr/min w temperaturze 4°C);

• powtórzyć jeszcze 3 razy płukanie w zimnej wodzie;

• po usunięciu wody z ostatniego płukania, bakterie zawiesić w 90 μl 10% zimnego, jałowego glicerolu, a probówki umieścić w lodzie;

• komórki odwirować (10 minut przy 9 tys. obr/min w temperaturze 4°C);

• odrzucić supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 90 μl 10% glicerolu - komórki stają się elektrokompetentne;

• porcje komórek elektrokompetentnych zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w -70°C.

UWAGA! Studenci otrzymują przygotowane wcześniej i zamrożone porcje komórek
elektrokompetentnych E. coli DH5α. Wykonują TYLKO elektroporację.

• porcje komórek elektrokompetentnych umieścić w lodzie na 30 minut;

• do każdej porcji komórek dodać 5 μl preparatu plazmidowego pGEM;

• komórki inkubować 30 minut w lodzie;

• zawiesinę przenieść do schłodzonych w lodzie kuwet 0,1 cm i poddać elektroporacji (2500 V, 100 Ω, 50 μF);

• kuwety z komórkami po elektroporacji inkubować w lodzie przez 15 minut;

• komórki zawiesić w 1 ml płynnego podłoża LB i przenieść do nowych probówek;

• komórki odwirować i usunąć prawie cały supernatant;

• komórki zawiesić w resztce supernatantu i wysiać 50-100 μl zawiesiny na płytki LB z ampicyliną przy pomocy głaszczki;

• płytki inkubować przez kilka dni w 28°C aż do pojawienia się pojedynczych koloni.

 

2. Transformacja:

• 50 ml płynnego podłoża LB zaszczepić przy pomocy 800 μl nocnej hodowli E. coli DH5α;      

• kolbkę z hodowlą inkubować w 37°C z wytrząsaniem do OD₆₀₀=0,3 - 0,4 (około 2 godzin);

• komórki odwirować w szklanych gilzach przez 5 minut przy 4 tys. obr/min;

• w międzyczasie przygotować 4 ml buforu TSS 1x stężonego (2x stężony bufor TSS - 2 ml, podłoże płynne LB - 1,8 ml, DMSO - 0,2 ml) i umieścić go w lodzie;

• usunąć supernatant, a odwirowane komórki zawiesić w 4 ml schłodzonego buforu TSS 1x stężonego - komórki stają się kompetentne;

• zawiesinę komórek kompetentnych rozpipetować po 100 μl do nowych probówek (trzymać w lodzie);

• próbki zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w -70°C.

UWAGA! Studenci otrzymują przygotowane wcześniej i zamrożone porcje komórek
kompetentnych E. coli DH5α. Wykonują TYLKO transformację.

• porcje komórek kompetentnych E. coli DH5α umieścić w lodzie na 30 minut;

• do każdej porcji rozmrożonych komórek dodać 2 μl preparatu plazmidowego pUC19;

• komórki inkubować w lodzie przez 30 minut;

• zawiesić komórki w 1 ml płynnego podłoża LB i inkubować 1h w 37°C;

• zawiesinę komórek odwirować (5 minut, 10 - 12 tys. obr/min);

• usunąć prawie cały supernatant, a w resztce podłoża zawiesić komórki;

• 50 - 100 μl zawiesiny wysiać na płytki z podłożem LB i ampicyliną przy pomocy głaszczki;

• płytki inkubować 24h w 37°C.

 

3. Koniugacja trójrodzicielska:

• odwirować (5 minut przy 12 tys. obr/min) w osobnych probówkach po 1,5 ml nocnej hodowli R. leguminosarum bv. viciae (biorca), E. coli pMPA221 (dawca) oraz E. coli pRK2030 (helper);

• odrzucić supernatant, a osad zawiesić w 1,5 ml płynnego podłoża 79CA i odwirować (5 minut przy 12 tys. obr/min);

• znowu odrzucić supernatant, a osad zawiesić w 1,5 ml płynnego podłoża 79CA;

• zmieszać zawiesiny bakteryjne trzech szczepów w nowej probówce w stosunku 1:1:2 (dawca:helper:biorca), po czym nakroplić mieszaninę na płytkę ze stałym podłożem 79CA;

• płytki inkubować w 28°C przez 24h.

UWAGA! Studenci otrzymują płytki z mieszaniną koniugujących szczepów dawcy,
biorcy i szczepu pomocniczego. Wykonują TYLKO selekcję szczepów po koniugacji.

• na płytkę z mieszaniną bakterii nanieść 2 ml płynnego podłoża 79CA lub jałowej wody i zmyć warstwę bakterii przy pomocy głaszczki;

• zawiesinę komórek nakroplić w ilości 50 - 100 μl na płytkę ze stałym podłożem 79CA oraz rifampicyną i tetracykliną (selekcja komórek biorcy, które otrzymały od dawcy plazmid pMPA221 z opornością na tetracyklinę) i wysiać głaszczką;

• inkubować płytki w 28°C przez 48h.