Ilona Kopeć, Olga Płaskoń, Paulina Lewandowska, Barbara Marek, Wojciech Ślęczek

Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych metodą chemiczną

Cel ćwiczenia:

Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych przy użyciu detergentu, Tween 80.

Liza detergentem - Tween 80

Metoda ta jest często używana do dezintegracji komórek utrzymywanych w hodowli tkankowej. Jest bardzo zachowawcza jeśli chodzi o własności izolowanych białek jeśli tylko stężenie detergentu potrzebnego do lizy komórek jest niewysokie. Najczęściej używane detergenty to: Triton X-100, NP-40, dodecylan sodowy, siarczan sarkozylu, deoksycholan sodowy i inne. W naszym doświadczeniu jako detergenta używamy Tween 80, jego zadaniem jest niszczenie ściany komórkowej. W ćwiczeniu korzystamy również z buforu ponieważ on niweluje ładunek w ścianie komórkowej.

Wykonanie:

10g drożdży piekarskich rozpuściliśmy w 50 ml wody destylowanej i wstawiliśmy do wirówki o temperaturze 4 ^oC na 5min. Następnie otrzymany osad rozpuściliśmy w 50 ml buforu i dodaliśmy 0,5ml odczynnika dezintegrującego, Tween 80 i inkubowaliśmy na wytrząsarce, w temperaturze 30°C przez 20min. Na koniec odwirowaliśmy po 5ml naszego ekstraktu, w dwóch probówkach i z otrzymanego roztworu wyznaczaliśmy stężenie białka metoda Bradford'a.

Metoda Bradford'a

1. Sporządzenie krzywej standardowej

• Posiadając wzorcowy roztwór albuminy o stężeniu 1mg/ml, sporządziliśmy 1ml roztworu albuminy o stężeniu 0,2 mg/ml w probówce eppendorfa. (0,2ml albuminy i 0,8ml wody destylowanej).

• Następnie w kolejnych probówkach eppendorfa przygotowaliśmy roztwory albuminy z 1ml odczynnika Bradforda

2. Oznaczanie ilości białka metodą Bradforda.

Odczynnik Bradforda:

• 100mg błękitu Coomasie Blue G rozpuszczono w 50ml 95% etanolu, następnie dodano 100ml 85% kwasu fosforowego i uzupełniono do objętości 1 litra wodą destylowaną.

Wykonanie:

W probówkach eppendorfa umieściliśmy po 1ml odczynnika Bradford'a a następnie dodawaliśmy odpowiednie ilości badanego roztworu i mieszaliśmy. Na koniec wykonaliśmy pomiar absorbancji przy 595nm wobec próby kontrolnej.

Obliczenia i wyniki:

1. Krzywa standardowa.

• Obliczanie masy białka albuminy w poszczególnych próbkach. Wyniki dla pozostałych objętości zamieszczone są w tabeli 1.

V₁=5 µl=0,005 ml

C_{0, albumina}=0,2 mg/ml

m= C_{0, albumina}·v₁=0,2·0,005=0,001 mg=1 µg

Tabela 1

v albuminy [µl]	A595 [nm]	m albuminy [µg]
5	-0,023	1
10	0,017	2
15	0,12	3
20	0,129	4
30	0,156	6
50	0,266	10
80	0,231	16

• Wykres zależności absorbancji od masy albuminy w poszczególnych próbkach. Do wyznaczenia linii trendu odrzuciliśmy punkt pierwszy, ponieważ znacznie odstawał on od reszty.

2. Oznaczanie ilości białka metodą Bradforda.

• Obliczanie masy białka w poszczególnych próbkach na podstawie zmierzonej absorbancji oraz wzoru funkcji krzywej standardowej. Wyniki dla pozostałych objętości zamieszczone są w tabeli 2.

Wzór krzywej standardowej.

A=0,019 m

A₁=0,042 nm

m₁= A/0,019=0,042/0,019=2,2105 µg

• Obliczanie stężenia białka na podstawie krzywej standardowej. Wyniki dla pozostałych mas i objętości zamieszczone są w tabeli 2.

m₁=2,2105 µg

v₁=0,010 ml

C_1e=m₁/v₁=2,2105/0,010=221,05 µg/ml

• Obliczanie średniego stężenia białka w próbkach.

C_śr=ΣC/6=210,47 µg/ml

Tabela 2

v białka [µl]	A595 [nm]	m ekstraktu [µg]	Ce [µg/ml]	C śr [µg/ml]	m w 10 ml [µg]
10	0,042	2,211	221,0526	223,19	2231,93
20	0,084	4,421	221,0526
30	0,154	8,105	270,1754
40	0,102	5,368	134,2105
50	0,256	13,474	269,4737

Wnioski:

Stężenie białka w ekstrakcie komórkowym wynosi: 223,19 µg/ml. Masa białka w całej próbce mającej objętość 10 ml wynosi: 2,23 mg

---