ĆWICZENIE II - EKSTRAKCJA RNA

Materiał: komórki

Metoda: izolacja przy użyciu odczynnika TRIZOL

Aparatura: wirówka, worteks

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (1000µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady,

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 1000µl, sterylne probówki 3 ml lub 5 ml, sterylne probówki 1,5 ml

Odczynniki: TRIZOL, chloroform, izopropanol, 75% etanol, ddH₂O

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe

Opis metody:

1. Do komórek dodać po 1 ml TRIZOLu

2. Dokładnie zworteksować aż do uzyskania jednolitego roztworu i inkubować przez 5 min. w temp. pokojowej dla zapewnienia kompletnej dysocjacji kompleksów nukleoproteinowych

3. Dodać 200 μl chloroformu na 1ml TRIZOLu. Po zamknięciu probówek intensywnie worteksować probówkę przez 15 sek., inkubować w temp. 15-30°C przez 2-3 min.

4. Wirować przy 12 000 x g przez 15 min. w temp 2-8°C.

5. Zebrać ostrożnie fazę wodną do osobnej probówki (ok.60% objętości TRIZOLu użytej do izolacji).

Faza organiczna zawiera DNA i białka - może być przechowywana przez noc w temp. 2-8°C.

6. Dodać 500 μl izopropanolu na 1 ml TRIZOLu użytego do homogenizacji.

7. Inkubować próbki temp. 15-30°C przez 10 min.

8. Wirować przy 12 000 x g przez 10 min. w temp 2-8°C.

9. Odrzucić supernatant.

10. Dodać 1 ml 75% etanolu (na 1 ml TRIZOLu), zworteksować.

11. Wirować przy 7 500 x g przez 5 min. w temp 2-8°C.

12. Wysuszyć osad w temp. pokojowej przez 5-10 min. NIE WOLNO PRZESUSZYĆ OSADU.

ĆWICZENIE III - EKSTRAKCJA DNA

Materiał: komórki

Metoda: izolacja z zastosowaniem minikolumienek przy użyciu zestawu firmy Akor Laboratories

Aparatura: wirówka, worteks, 2 termobloki

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (100-1000µl, 20-200µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 1000µl i 200µl, sterylne probówki 1,5 ml i 2 ml

Odczynniki: bufor Tris, bufor LT, proteinaza K, roztwór płuczący A1, ddH₂O

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe

Opis metody:

1. Komórki w ilości 1x10⁶ odwirować i zawiesić w 100μl buforu Tris.

2. Do zawiesiny komórek dodać 200μl buforu lizującego LT

3. Dodać 20μl Proteinazy K (400μg)

4. Całość wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C

5. Przenieść próbkę do 75°C i inkubować przez 5 minut

6. Próbkę intensywnie worteksować przez 20 sekund

7. Wirować 3 minuty przy 13000 RPM

8. Supernatant nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA

9. Wirować 1 minutę przy 13000 RPM

10. Nanieść na minikolumnę 500μl roztworu płuczącego A1

11. Wirować 1 minutę przy 13000 RPM

12. Minikolumnę przenieść do nowej probówki (2 ml) i nanieść 300μl roztworu płuczącego A1

13. Wirować 2 minuty przy 13000 RPM

14. Ogrzać wodę apirogenną do temperatury 75°C

15. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce (1,5 ml) i nanieść 50μl wody apirogennej (ogrzanej do temperatury 75°C)

16. Inkubować w temperaturze 75°C przez 5 minut

17. Wirować 1 minutę przy 13000 RPM

18. Minikolumnę usunąć a oczyszczone DNA przechowywać do czasu dalszych analiz

w temperaturze +4°C.

ĆWICZENIE IV - OCENA JAKOŚCIOWA EKSTRAKTÓW RNA I DNA

Materiał: ekstrakty RNA i DNA

Metoda: elektroforeza w 1% i 0,8% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny,

Aparatura: aparat do elektroforezy agarozowej, zasilacz, kuchenka mikrofalowa, worteks, waga laboratoryjna

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10 i 10-200 µl), statywy na probówki, kolba szklana

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 200 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml

Odczynniki: agaroza, 1 - krotny bufor TBE(0,089M TRIS, 0,089M kwas borowy, 0,002M EDTA),

bufor obciążający (0,09% w/v błękit bromofenolowy, 0,09% w/v ksylen cyjanolowy FF, 60% glicerol,

60mM EDTA), roztwór bromku etydyny, ddH₂O

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe

Opis metody:

Żel agarozowy 1% (RNA):

13. Saneczki (płytkę) umieścić na papierowym ręczniku na stole.

14. Zabezpieczyć brzegi saneczek i umieścić grzebień - sprawdzić czy saneczki są wypoziomowane,

a grzebień ułożony równomiernie.

15. Odważyć 0,4g agarozy i przenieść do kolby.

16. Dopełnić 1-krotnym buforem TBE do objętości 40 ml.

17. Rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej.

18. Roztwór ostudzić do temperatury 60°C i dodać 18 µl bromku etydyny (końcowe stężenie 0,5 µg/ml).

19. Wylać agarozę na saneczki i pozostawić na 30-45 min w temp. pokojowej.

Żel agarozowy 0,8% (DNA):

1. Przygotować aparat (jak wyżej)

2. Odważyć 0,32g agarozy i przenieść do kolby i dopełnić 1-krotnym buforem TBE do objętości 40 ml.

3. Przygotować żel (jak wyżej).

W tym czasie rozpuścić ekstrakt RNA w 30µl ddH₂O. Po rozpuszczeniu ekstraktu odporcjować do probówek 5 µl

(probówki 0,2 ml). Do 98 µl ddH₂O dodać 2 µl ekstraktu (rozcieńczenie 50x) (probówki 1,5 ml). Ekstrakt stężony

oraz rozcieńczony (do pomiaru stężenia) zamrozić do czasu dalszych analiz.

4. Po spolimeryzowaniu żelu umieścić saneczki w aparacie do elektroforezy.

5. Wlać do aparatu 1-krotny bufor TBE (około 450 ml).

6. Wyjąć delikatnie (tak, aby nie uszkodzić żelu) zabezpieczenia na brzegach saneczek oraz grzebień.

7. Zmieszać (poprzez pipetowanie) 2 µl buforu obciążającego z 5 µl RNA i nałożyć do utworzonych

w 1% żelu studzienek.

8. Zmieszać (poprzez pipetowanie) 2 µl buforu obciążającego z 5 µl DNA i nałożyć do utworzonych

w 0,8% żelu studzienek.

9. Podłączyć elektrody do źródła prądu i prowadzić rozdział przy stałym napięciu wynoszącym 120V

do momentu przebycia przez barwnik 2/3 długości żelu (około 45 minut)

10. Ocenę jakościową elektroforegramu przeprowadzić przy użyciu transiluminatora UV

ĆWICZENIE V - OCENA ILOŚCIOWA

EKSTRAKTÓW RNA I DNA

Materiał: ekstrakty RNA i DNA

Metoda: pomiar absorpcji światła UV

Aparatura: worteks, wirówka, GeneQuant

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10 i 10-200 µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady,

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 200 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml

Odczynniki: ddH₂O

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe

1. Rozmrozić rozcieńczony ekstrakt RNA (rozcieńczenie 50x)

2. Ekstrakty RNA i DNA zworteksować i zwirować

3. Odporcjować 2 µl ekstraktu DNA i dodać 98 µl ddH₂O

4. Kalibrację aparatu przeprowadzić dla wody, w której rozpuszczono i rozcieńczono ekstrakty

5. Stężenie całkowitego RNA wyznaczyć spektrofotometrycznie z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant przy założeniu, że 1 OD dla roztworu RNA odpowiada ilości 40μg

6. Stężenie całkowitego DNA dla DNA wyznaczyć spektrofotometrycznie z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant przy założeniu, że 1 OD odpowiada ilości 50μg.

ĆWICZENIE IX - AMPLIFIKACJA FRAGMENTU
mRNA GENU GAPDH TECHNIKĄ RT-PCR

Materiał: ekstrakt RNA

Technika: RT-PCR

Aparatura: komora laminarna, amplifikator, worteks, wirówka

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10 i 10-200 µl), statywy na probówki, pojemnik na odpady

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 200 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml

Odczynniki: zestaw do amplifikacji techniką RT-PCR MasterAmp Tth DNA Polymerase, startery, ddH₂O

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, rękawiczki lateksowe

Opis metody:

20. Przygotować matrycę RNA (doprowadzić do stężenia zalecanego w protokole amplifikacji.

21. Przeliczyć objętości składników mieszaniny reakcyjnej dla 7 prób (140ၭl - dla 5 matryc badanych,

1 kontrola ujemna, tzw. zapas).

22. Każdy z odczynników zworteksować i zwirować przed użyciem.

23. Przygotować mieszaninę reakcyjną z podanych składników (za wyjątkiem matrycy) na 140ၭl według protokołu amplifikacji

odczynnik	proporcja na 100ၭl		analiza bieżąca na................ ၭl	analiza bieżąca na 20 ၭl
		stężenie	ilość (ၭl)	ilość (ၭl)
20x PCR bufor Tth	1x	5		1
25 mM MnSO4	0,5 mM	2		0,4
25 mM MgCl2	3 mM	12		2,4
wzmacniacz amplifikacji 10x	1x	10		2
2,5 mM dNTP mix	po 200 ၭM każdy	8		1,6
primer forward 10 ၭM	0,3 ၭM	1,25		0,25
primer reverse 10 ၭM	0,3 ၭM	1,25		0,25
polimeraza Tth	5 U/ၭl	1		0,2
matryca	0,100-0,200 ၭg
ddH2O

24. Mieszaninę zworteksować, zwirować i rozporcjować do probówek 0,2 ml objętość pomniejszoną o objętość matrycy przypadającą na próbkę

25. Do każdej z probówek do mieszaniny reakcyjnej dodać matrycę według schematu:

26. Po zworteksowaniu i zwirowaniu probówki umieścić w amplifikatorze i włączyć program 80, zaprojektowany dla następującego profilu termicznego:

50°C 5 min, 60°C 30 min - odwrotna transkrypcja

94°C 10 min - denaturacja wstępna

94°C 30 sek.

55°C 30 sek. 40 cykli

72°C 45 sek.

72°C 5 min - końcowe wydłużanie produktów

ĆWICZENIE XI - OCENA SPECYFICZNOŚCI PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI

Materiał: produkty amplifikacji

Metoda: rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji w 6% żelu poliakrylamidowym, barwionym metodą srebrową

Aparatura: aparat do elektroforezy poliakrylamidowej, zasilacz, worteks

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10, 1000 µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady,

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 100 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml

Odczynniki: roztwór poliakrylamidu, TEMED (l N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy), nadsiarczan amonu, 10 - krotny bufor TBE (0,089M TRIS, 0,089M kwas borowy, 0,002M EDTA), bufor obciążający (0,09% w/v błękit bromofenolowy, 0,09% w/v ksylen cyjanolowy FF, 60% glicerol, 60mM EDTA), ddH₂O, marker wielkości pBR322 DNA/BsuRI, do barwienia - 20% TCA, 2% formaldehyd, 0,4% AgNO₃, 2,5% Na₂CO₃, 5% kwas octowy

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, rękawiczki lateksowe

Opis metody:

1. Żel poliakrylamidowy

przygotowanie mieszaniny A

1. 3 ml 40% roztworu akrylamidu (38:2 akrylamid:N,N'-metylenobisakrylamid)

2. 2 ml 10-krotnego buforu TBE

3. uzupełnić wodą dejonizowaną do objętości 20 ml

4. dodać do mieszaniny poliakrylamidu i buforu 15 mg nadsiarczanu amonu

przygotowanie korka

1. do 2 ml mieszaniny A dodać 20μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED)

2. szybko wymieszać i wylać pomiędzy płyty

3. odczekać ok. 10 min aż korek spolimeryzuje

przygotowanie żelu

1. do pozostałej objętości mieszaniny A dodać 20μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED)

2. szybko wymieszać i wylać pomiędzy płyty

3. po spolimeryzowaniu żel umieścić w aparacie do elektroforezy w 1-krotnym buforze TBE.

2. Rozdział elektroforetyczny

Wymieszać:0,5μl buforu obciążającego, 6μl próbki lub 0,8 μl markera wielkości pBR322 DNA/BsuRI i wprowadzić do studzienki w żelu. Rozdział elektroforetyczny prowadzić w temperaturze 4°C przy stałym napięciu wynoszącym 100V do momentu przebycia przez barwnik całej długości żelu.

3. Barwienie

UWAGA pkt 3.10! Odmierzyć wcześniej objętość 149 ml 2,5% Na₂CO₃, natomiast 1 ml 2% formaldehydu dodać i zamieszać bezpośrednio przed użyciem

Po elektroforezie podważyć jedną z szyb przekładką lub grzebieniem, a następnie zanurzyć drugą szybę z przyklejonym żelem (żelem w kierunku dna wanienki) w 20% roztworze TCA
i przenieść żel do roztworu

1. 20% TCA - 5 min

2. 2% formaldehyd - 6 min (można zastąpić 5% glutaraldehydem)

3. płukanie w ddH₂O - 2 min

4. płukanie w ddH₂O - 2 min

5. barwienie w 0,4% AgNO₃ - 10 min

6. płukanie w ddH₂O - 2,5 min

7. płukanie w ddH₂O - 0,5 min

8. płukanie w ddH₂O - 0,5 min

9. przygotować przed dodaniem 149 ml 2,5% Na₂CO₃ + 1 ml 2% formaldehydu

10. wywoływanie 2-3 porcjami aż do momentu pojawienia się pasków

11. zatrzymanie reakcji 5% kwasem octowym - 7 min

12. ddH₂O - przechowywanie w 4°C

13. Zamknąć w folii i pozostawić do wyschnięcia

ODCZYNNIKI:

20% TCA: 200g, uzupełnić ddH₂O do objętości 1000 ml

2% formaldehyd: 54,4 ml formaldehydu, uzupełnić ddH₂O do objętości 1000 ml

0,4% AgNO₃: 4g, uzupełnić ddH₂O do objętości 1000 ml

2,5% Na₂CO₃: 25g, uzupełnić ddH₂O do objętości 1000 ml

5% kwas octowy: 31,25 80% kwasu octowego, uzupełnić ddH₂O do objętości 500 ml

1 2 3 4 5 6

matryca matryca matryca matryca matryca kontrola

badana 1 badana 2 badana3 badana4 ujemna ujemna

---