ĆWICZENIE II - EKSTRAKCJA RNA
Materiał: komórki
Metoda: izolacja przy użyciu odczynnika TRIZOL
Aparatura: wirówka, worteks
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (1000µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady,
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 1000µl, sterylne probówki 3 ml lub 5 ml, sterylne probówki 1,5 ml
Odczynniki: TRIZOL, chloroform, izopropanol, 75% etanol, ddH2O
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe
Opis metody:
Do komórek dodać po 1 ml TRIZOLu
Dokładnie zworteksować aż do uzyskania jednolitego roztworu i inkubować przez 5 min. w temp. pokojowej dla zapewnienia kompletnej dysocjacji kompleksów nukleoproteinowych
Dodać 200 μl chloroformu na 1ml TRIZOLu. Po zamknięciu probówek intensywnie worteksować probówkę przez 15 sek., inkubować w temp. 15-30°C przez 2-3 min.
Wirować przy 12 000 x g przez 15 min. w temp 2-8°C.
Zebrać ostrożnie fazę wodną do osobnej probówki (ok.60% objętości TRIZOLu użytej do izolacji).
Faza organiczna zawiera DNA i białka - może być przechowywana przez noc w temp. 2-8°C.
Dodać 500 μl izopropanolu na 1 ml TRIZOLu użytego do homogenizacji.
Inkubować próbki temp. 15-30°C przez 10 min.
Wirować przy 12 000 x g przez 10 min. w temp 2-8°C.
Odrzucić supernatant.
Dodać 1 ml 75% etanolu (na 1 ml TRIZOLu), zworteksować.
Wirować przy 7 500 x g przez 5 min. w temp 2-8°C.
Wysuszyć osad w temp. pokojowej przez 5-10 min. NIE WOLNO PRZESUSZYĆ OSADU.
ĆWICZENIE III - EKSTRAKCJA DNA
Materiał: komórki
Metoda: izolacja z zastosowaniem minikolumienek przy użyciu zestawu firmy Akor Laboratories
Aparatura: wirówka, worteks, 2 termobloki
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (100-1000µl, 20-200µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 1000µl i 200µl, sterylne probówki 1,5 ml i 2 ml
Odczynniki: bufor Tris, bufor LT, proteinaza K, roztwór płuczący A1, ddH2O
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe
Opis metody:
Komórki w ilości 1x106 odwirować i zawiesić w 100μl buforu Tris.
Do zawiesiny komórek dodać 200μl buforu lizującego LT
Dodać 20μl Proteinazy K (400μg)
Całość wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C
Przenieść próbkę do 75°C i inkubować przez 5 minut
Próbkę intensywnie worteksować przez 20 sekund
Wirować 3 minuty przy 13000 RPM
Supernatant nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA
Wirować 1 minutę przy 13000 RPM
Nanieść na minikolumnę 500μl roztworu płuczącego A1
Wirować 1 minutę przy 13000 RPM
Minikolumnę przenieść do nowej probówki (2 ml) i nanieść 300μl roztworu płuczącego A1
Wirować 2 minuty przy 13000 RPM
Ogrzać wodę apirogenną do temperatury 75°C
Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce (1,5 ml) i nanieść 50μl wody apirogennej (ogrzanej do temperatury 75°C)
Inkubować w temperaturze 75°C przez 5 minut
Wirować 1 minutę przy 13000 RPM
Minikolumnę usunąć a oczyszczone DNA przechowywać do czasu dalszych analiz
w temperaturze +4°C.
ĆWICZENIE IV - OCENA JAKOŚCIOWA EKSTRAKTÓW RNA I DNA
Materiał: ekstrakty RNA i DNA
Metoda: elektroforeza w 1% i 0,8% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny,
Aparatura: aparat do elektroforezy agarozowej, zasilacz, kuchenka mikrofalowa, worteks, waga laboratoryjna
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10 i 10-200 µl), statywy na probówki, kolba szklana
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 200 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml
Odczynniki: agaroza, 1 - krotny bufor TBE(0,089M TRIS, 0,089M kwas borowy, 0,002M EDTA),
bufor obciążający (0,09% w/v błękit bromofenolowy, 0,09% w/v ksylen cyjanolowy FF, 60% glicerol,
60mM EDTA), roztwór bromku etydyny, ddH2O
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe
Opis metody:
Żel agarozowy 1% (RNA):
Saneczki (płytkę) umieścić na papierowym ręczniku na stole.
Zabezpieczyć brzegi saneczek i umieścić grzebień - sprawdzić czy saneczki są wypoziomowane,
a grzebień ułożony równomiernie.
Odważyć 0,4g agarozy i przenieść do kolby.
Dopełnić 1-krotnym buforem TBE do objętości 40 ml.
Rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej.
Roztwór ostudzić do temperatury 60°C i dodać 18 µl bromku etydyny (końcowe stężenie 0,5 µg/ml).
Wylać agarozę na saneczki i pozostawić na 30-45 min w temp. pokojowej.
Żel agarozowy 0,8% (DNA):
Przygotować aparat (jak wyżej)
Odważyć 0,32g agarozy i przenieść do kolby i dopełnić 1-krotnym buforem TBE do objętości 40 ml.
Przygotować żel (jak wyżej).
W tym czasie rozpuścić ekstrakt RNA w 30µl ddH2O. Po rozpuszczeniu ekstraktu odporcjować do probówek 5 µl
(probówki 0,2 ml). Do 98 µl ddH2O dodać 2 µl ekstraktu (rozcieńczenie 50x) (probówki 1,5 ml). Ekstrakt stężony
oraz rozcieńczony (do pomiaru stężenia) zamrozić do czasu dalszych analiz.
Po spolimeryzowaniu żelu umieścić saneczki w aparacie do elektroforezy.
Wlać do aparatu 1-krotny bufor TBE (około 450 ml).
Wyjąć delikatnie (tak, aby nie uszkodzić żelu) zabezpieczenia na brzegach saneczek oraz grzebień.
Zmieszać (poprzez pipetowanie) 2 µl buforu obciążającego z 5 µl RNA i nałożyć do utworzonych
w 1% żelu studzienek.
Zmieszać (poprzez pipetowanie) 2 µl buforu obciążającego z 5 µl DNA i nałożyć do utworzonych
w 0,8% żelu studzienek.
Podłączyć elektrody do źródła prądu i prowadzić rozdział przy stałym napięciu wynoszącym 120V
do momentu przebycia przez barwnik 2/3 długości żelu (około 45 minut)
Ocenę jakościową elektroforegramu przeprowadzić przy użyciu transiluminatora UV
ĆWICZENIE V - OCENA ILOŚCIOWA
EKSTRAKTÓW RNA I DNA
Materiał: ekstrakty RNA i DNA
Metoda: pomiar absorpcji światła UV
Aparatura: worteks, wirówka, GeneQuant
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10 i 10-200 µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady,
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 200 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml
Odczynniki: ddH2O
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe
Rozmrozić rozcieńczony ekstrakt RNA (rozcieńczenie 50x)
Ekstrakty RNA i DNA zworteksować i zwirować
Odporcjować 2 µl ekstraktu DNA i dodać 98 µl ddH2O
Kalibrację aparatu przeprowadzić dla wody, w której rozpuszczono i rozcieńczono ekstrakty
Stężenie całkowitego RNA wyznaczyć spektrofotometrycznie z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant przy założeniu, że 1 OD dla roztworu RNA odpowiada ilości 40μg
Stężenie całkowitego DNA dla DNA wyznaczyć spektrofotometrycznie z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant przy założeniu, że 1 OD odpowiada ilości 50μg.
ĆWICZENIE IX - AMPLIFIKACJA FRAGMENTU
mRNA GENU GAPDH TECHNIKĄ RT-PCR
Materiał: ekstrakt RNA
Technika: RT-PCR
Aparatura: komora laminarna, amplifikator, worteks, wirówka
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10 i 10-200 µl), statywy na probówki, pojemnik na odpady
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 200 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml
Odczynniki: zestaw do amplifikacji techniką RT-PCR MasterAmp Tth DNA Polymerase, startery, ddH2O
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, rękawiczki lateksowe
Opis metody:
Przygotować matrycę RNA (doprowadzić do stężenia zalecanego w protokole amplifikacji.
Przeliczyć objętości składników mieszaniny reakcyjnej dla 7 prób (140ၭl - dla 5 matryc badanych,
1 kontrola ujemna, tzw. zapas).
Każdy z odczynników zworteksować i zwirować przed użyciem.
Przygotować mieszaninę reakcyjną z podanych składników (za wyjątkiem matrycy) na 140ၭl według protokołu amplifikacji
odczynnik |
proporcja na 100ၭl |
analiza bieżąca na................ ၭl |
analiza bieżąca na 20 ၭl |
|
|
stężenie |
ilość (ၭl) |
ilość (ၭl) |
|
20x PCR bufor Tth |
1x |
5 |
|
1 |
25 mM MnSO4 |
0,5 mM |
2 |
|
0,4 |
25 mM MgCl2 |
3 mM |
12 |
|
2,4 |
wzmacniacz amplifikacji 10x |
1x |
10 |
|
2 |
2,5 mM dNTP mix |
po 200 ၭM każdy |
8 |
|
1,6 |
primer forward 10 ၭM |
0,3 ၭM |
1,25 |
|
0,25 |
primer reverse 10 ၭM |
0,3 ၭM |
1,25 |
|
0,25 |
polimeraza Tth |
5 U/ၭl |
1 |
|
0,2 |
matryca |
0,100-0,200 ၭg |
|
|
|
ddH2O |
|
|
|
|
Mieszaninę zworteksować, zwirować i rozporcjować do probówek 0,2 ml objętość pomniejszoną o objętość matrycy przypadającą na próbkę
Do każdej z probówek do mieszaniny reakcyjnej dodać matrycę według schematu:
Po zworteksowaniu i zwirowaniu probówki umieścić w amplifikatorze i włączyć program 80, zaprojektowany dla następującego profilu termicznego:
50°C 5 min, 60°C 30 min - odwrotna transkrypcja
94°C 10 min - denaturacja wstępna
94°C 30 sek.
55°C 30 sek. 40 cykli
72°C 45 sek.
72°C 5 min - końcowe wydłużanie produktów
ĆWICZENIE XI - OCENA SPECYFICZNOŚCI PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI
Materiał: produkty amplifikacji
Metoda: rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji w 6% żelu poliakrylamidowym, barwionym metodą srebrową
Aparatura: aparat do elektroforezy poliakrylamidowej, zasilacz, worteks
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (0,5-10, 1000 µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady,
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 10 i 100 µl, sterylne probówki 0,2 i 1,5 ml
Odczynniki: roztwór poliakrylamidu, TEMED (l N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy), nadsiarczan amonu, 10 - krotny bufor TBE (0,089M TRIS, 0,089M kwas borowy, 0,002M EDTA), bufor obciążający (0,09% w/v błękit bromofenolowy, 0,09% w/v ksylen cyjanolowy FF, 60% glicerol, 60mM EDTA), ddH2O, marker wielkości pBR322 DNA/BsuRI, do barwienia - 20% TCA, 2% formaldehyd, 0,4% AgNO3, 2,5% Na2CO3, 5% kwas octowy
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, rękawiczki lateksowe
Opis metody:
Żel poliakrylamidowy
przygotowanie mieszaniny A
3 ml 40% roztworu akrylamidu (38:2 akrylamid:N,N'-metylenobisakrylamid)
2 ml 10-krotnego buforu TBE
uzupełnić wodą dejonizowaną do objętości 20 ml
dodać do mieszaniny poliakrylamidu i buforu 15 mg nadsiarczanu amonu
przygotowanie korka
do 2 ml mieszaniny A dodać 20μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED)
szybko wymieszać i wylać pomiędzy płyty
odczekać ok. 10 min aż korek spolimeryzuje
przygotowanie żelu
do pozostałej objętości mieszaniny A dodać 20μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED)
szybko wymieszać i wylać pomiędzy płyty
po spolimeryzowaniu żel umieścić w aparacie do elektroforezy w 1-krotnym buforze TBE.
Rozdział elektroforetyczny
Wymieszać:0,5μl buforu obciążającego, 6μl próbki lub 0,8 μl markera wielkości pBR322 DNA/BsuRI i wprowadzić do studzienki w żelu. Rozdział elektroforetyczny prowadzić w temperaturze 4°C przy stałym napięciu wynoszącym 100V do momentu przebycia przez barwnik całej długości żelu.
Barwienie
UWAGA pkt 3.10! Odmierzyć wcześniej objętość 149 ml 2,5% Na2CO3, natomiast 1 ml 2% formaldehydu dodać i zamieszać bezpośrednio przed użyciem
Po elektroforezie podważyć jedną z szyb przekładką lub grzebieniem, a następnie zanurzyć drugą szybę z przyklejonym żelem (żelem w kierunku dna wanienki) w 20% roztworze TCA
i przenieść żel do roztworu
20% TCA - 5 min
2% formaldehyd - 6 min (można zastąpić 5% glutaraldehydem)
płukanie w ddH2O - 2 min
płukanie w ddH2O - 2 min
barwienie w 0,4% AgNO3 - 10 min
płukanie w ddH2O - 2,5 min
płukanie w ddH2O - 0,5 min
płukanie w ddH2O - 0,5 min
przygotować przed dodaniem 149 ml 2,5% Na2CO3 + 1 ml 2% formaldehydu
wywoływanie 2-3 porcjami aż do momentu pojawienia się pasków
zatrzymanie reakcji 5% kwasem octowym - 7 min
ddH2O - przechowywanie w 4°C
Zamknąć w folii i pozostawić do wyschnięcia
ODCZYNNIKI:
20% TCA: 200g, uzupełnić ddH2O do objętości 1000 ml
2% formaldehyd: 54,4 ml formaldehydu, uzupełnić ddH2O do objętości 1000 ml
0,4% AgNO3: 4g, uzupełnić ddH2O do objętości 1000 ml
2,5% Na2CO3: 25g, uzupełnić ddH2O do objętości 1000 ml
5% kwas octowy: 31,25 80% kwasu octowego, uzupełnić ddH2O do objętości 500 ml
1 2 3 4 5 6
matryca matryca matryca matryca matryca kontrola
badana 1 badana 2 badana3 badana4 ujemna ujemna