Wykład 4
klonowanie zarodków
- klon - potomstwo jednej komórki lub jednego osobnika powstałe w wyniku rozmnażania
bezpłciowego u zwierząt i wegetatywnego u roślin (klon - gałązka, pęd)
poliembronia - u pancernika (Dasypus novemcinctus) tu cztery monozygotyczne wieloraczki,
a u D. hybridus od 7 do 12
- blastomery są totipotentne (omnipotentne)
- u myszy i szczura do stadium dwukomórkowego
- u bydła, owcy, królika do stadium ośmiokomórkowego
- u konia do stadium cztero komórkowego
- totipotencja tylko do pewnego stadium, nie jest to związane z wielkością
danego organizmu, ale z jego specyficznością
metoda klonowania ssaków
- izolacja blastomerów zarodków 2,4,8-komórkowych (badania Tarkowskiego w
latach 50tych XXw., wykazały one totipotencję blastomerów w stadium
dwukomórkowym)
- najczęściej dzielenie (bisekcja) zarodków w stadium moruli lub blastocysty
- regeneracja blastomerów (klony chimerowe, znaczenie poznawcze)
- transplantacja jąder komórkowych zarodków do enukleowanych oocytów i zygot
izolacja blastomerów
- usunięcie osłonki przejrzystej
- pipetowanie zarodków 2,4-komórkowych (dezagregacja na pojedyncze blastomery)
- inkubacja zarodków 4,8- komórkowych przed pipetowaniem (rozdział zarodków starszych
przed stadium blastocysty)
- w przypadku zarodków starszych (4-26-komórkowe) uzyskiwanie pojedynczych
blastomerów z całych zarodków za pomocą mikropipety wprowadzanej w osłonkę
przejrzystą
- inkubacja blastomerów, hodowla in vitro do stadium moruli i blastocysty
- wszczepienie do macicy biorczyni
bisekcja zarodków
- mikrochirurgicznyczny podział zarodka cienką igłą szklaną lub mikroskalpelem
- podział zarodka w stadium blastocysty (węzeł zarodkowy dzielony na połowę)
- podział w stadium moruli zupełnie dowolny
- u owiec i u bydła
- zaleta klonowania zarodków to wzrost liczebności najlepszego materiału genetycznego
zwierzęcia
Tetra - „jedna z czterech”, powstała w wniku klonowania poprzez podział zarodka
- zapłodnienie komórki jajowej makaka
- hodowla zarodka
- podział 8-komórkowego zarodka na cztery identyczne części
- implantacja czterech z ośmiu zarodków do matek zastępczych
- narodziny Tetry
klonowanie chimerowe
chimera - organizm allofeniczny, organizm zbudowany z komórek przychodzących z dwóch lub więcej
organizmów różniących się pod względem genetycznym (pierwsze chimery uzyskał prof.
Tarkowski na myszach, chimery wykorzystywał do badań nad zarodkami)
- u kozoowcy - markerem jest rodzaj wełny
- u drobiu - markerem jest kolor piór
- biorca i dawca - takie samo stadium rozwoju zarodka (biorca to
oocyt lub zygota bez jądra)
transplantacja jąder
- zastąpienie jądra komórki jajowej jądrem z komórki starszej zarodków (2-32-komórkowe) - komórka biorca - oocyt z usuniętymi chromosomami ułożony na płytkę metafazową, zygota
(usunięte jedno lub dwa przedjądrza)
- komórki dawcy muszą być zdegradowane na pojedyncze komórki
czynniki fuzjogenne
- PEG
- lub pipetą pod osłoną przejrzystą
- wirus Sendai (wirus grypy)
- elektroporacja prądem mieszanym (5 sekund prądem zmiennym 4-5V, 500kHz)
(prąd stały 200-300V przez 15-25-40 μsek)
- dawcą może być zarodek lub komórka hodowana in vitro
- wykorzystanie jąder hodowanych in vitro komórek pochodzenia zarodkowego i komórek płodowych w
klonowaniu owcy
typ dawcy komórki pochodzenie
- nabłonkopodobne - tarczka zarodkowa, węzeł jagnięta zarodkowy
- fibroblasty płodowe - 26-dniowe płody, jagnięta
- trasformowane genetycznie fibroblasty - jagnięta transgeniczne
u bydła
- typ komórek dawcy - fibroblasty i fibroblasty płodowe
- pochodzenie - skóra płodów, mięśnie płodów
klonowanie somatyczne
- dawcy jąder
- komórki pochodzenia zarodkowego hodowane in vitro
- komórki z linii wyprowadzonej z węzła zarodkowego
- komórki pochodzenia płodowego (np. fibroblasty)
- komórki osobników zarodków
- biorcy jąder
- enukleowane oocyty
1966r. - metoda mikroiniekcji, DNA wprowadzone do zygoty mysiej, był to początek ery klonów i zwierząt
transgenicznych
- Dolly (pierwszy klon somatyczny, 1996r.)
- mysz Cumulina (1998r.)
- mysz Fibrio (samiec, 1999r.)
- kotka Caroon Copy, cztery króli bezimienne (2001r.)
- muł Idahogen, klacz Prometea, jelonek Dewey, szczur Ralph (2003r.)
- znacznie trudniej klonować jest płeć męską (męskie noworodki znacznie słabsze)
klonowanie zwierząt gospodarskich
- pierwszy klon niezwykle odporny na choroby buhaja Bull (padł w 1997r.), a klon w 2000r. to
trangeniczne cielę odporne na buleriozę, gruźlicę, salmonellę. (można klonować z martwych
organizmów)
- Xena - sklonowana świnka
- źródło DNA (fibroblasty 24-dniowe, płód to czarno umaszczona świnia)
- transfer 110 zarodków (klonów) 4 samic, biorczyń biało umaszczonych
- locha, której wprowadzono 36 zarodków urodziła czarne prosię
- zastosowanie metody pobrania za pomocą mikroigły, tak samo
wprowadzenie, do fuzji użyto prądu elektrycznego (tak samo jak
w przypadku myszy Cumulina)
- potwierdzenie klonu - fenotypowo - umaszczenie czarne
- DNA - badane molekularnie
- 2003r. - jeleń sklonowany w USA (jeleń białoogoniasty, dobrej jakości mięso i rogi), Dewey,
pierwszy na świecie
- komórki dawcy (fibroblasty ze skóry padłego jelenia)
- komórki biorcy (oocyty z jajników łani, „dojrzewanie” in vitro)
2003r. - królik, klon czy chimera?
- dawczyni - komórka uch samicy transgenicznej (hormon wzrostu człowieka w mleku)
- samiczka WT20
perspektywy metody
- uzyskiwanie klonów zwierząt transgenicznych (producentów
terapeutycznych białek ludzkich)
- modyfikacja narządów zwierzęcych do ksenotransplantacji
klony klonów zwierząt gospodarskich
- buhaj
- trzy pokolenia klonów myszy (metoda związana z „Honolulu technique”)
- 2001r. - klon kotka w USA
- klon ma informację genetyczną (dziedziczone po matce)
mitochondrialnego DNA biorcy i DNA jądrowe dawcy
- 2003r. - koń sklonoany we Włoszech (rasa: Halfinger)
- 2003r. - Prometea, „caroon copy” klaczy (1 z 328 zarodków, 14 blastocyst), urodzona 28.05.,
waga 36kg, długość ciąży to 336 dni, a więc dłuższa niż naturalna
- DNA jądrowe z komórki skóry
- matka zastępcza to ta sama klacz
- oocyty z jajników pobranych w rzeźni
- potwierdzenie klonu - badanie polimorfizmu, mikrosatelitarne matki i źrebięcia
- 2005 r. - Pieraz, krypzootech, Stallion, źrebię urodzone 25.02, waga 42 kg
- dawcą materiału genetycznego był wielokrotny triumfator wyścigów Pieraz, który
został wykastrowany
- 2005r. - Paris Texas, urodzony 13.03.
- materiał genetyczny z komórek skóry
- uzyskano 6 embrionów, ciąża trwała 12,5 miesiąca (normalnie 11 miesięcy)
- muł (63 chromosomy) - Idaho Gem (1 z 305 implantatów zarodków)
- koń 64 chromosomy
- osioł 62 chromosomy
- dawca (komórki płodu muła)
- biorca (wyjądrzone komórki jajowe klaczy konia)
- matka zastępcza (klacze konia)
- DNA 45-dniowego muła fibroblastu płodu
- wzbogacenie medium do kultury in vitro wapniem (zarodki utrzymują się i aktywują tutaj, tu
następują narodziny klonu)
- 2003r. - szczur (sklonowany w INRA, Francja)
- zbyt szybko nastąpiło przejście z metafazy do anafazy (to przeszkadzało)
- ale zachowanie stadium metafazy na 3h sprzyjało klonowaniu
(MG132 inhibitor proteaz)
- 2005r. - pies
- dawca (komórki skóry ucha trzy letniego Charta Afgańskiego)
- biorca ( komórki jajowe wyjądrzone suki Labradora)
- pobrano 1460 komórek jajowych od ponad 100 suk
- 1095 sklonowanych komórek - 123 zarodki - matka zastępcza - 2 szczenięta - 1
przeżył, drugi po 20 dniach zdechł na zapalenie płuc
- w warunkach labolatoryjnych oocyt suki jest bardzo trudny do dojrzewania
klonowanie gatunków zagrożonych
- klon muflona
- dawcy (komórki skóry z martwych muflonów z Sardynii)
- biorcy (oocyty owcy)
- matka zastępcza (owca, 4 samice)
- klon geparda
- program klonowania w Indiach, gdzie wyginęły ponad 50 lat temu
- w Afryce (5-25 tysięcy gepardów)
- w niewoli 1000 gepardów
- klon bukardo
- w Hiszpanii zachowywano zamrożone tkanki ostatnich samic
- plany uzyskiwania samca przez usunięcie jednego chromosomu X z komórek samicy
bukardo lub dodania dodatkowego chromosomu Y blisko spokrewnionego samca
kozy
- klon antylopy bongo
- dawca (bongo)
- matki zastępcze (znacznie większa antylopa eland, klony, zatem znacznie większe
niż powinny być naturalnie)
- klon pandy wielkiej
- mało efektywne metody sztucznej inseminacji
- plany to matka zastępcza (samica czarnego niedźwiedzia)
- oocyty od martwej pandy
- biorca to samica czarnego niedźwiedzia
- klon azjatyckiego gaura
- pierwszy raz matka zastępcza zastosowana z innego gatunku
- dawca (komórki skóry gaura)
- biorca (oocyty krowy)
- uzyskano 81 zarodków - 44zarodki do 32 krów - jedno ciele padło przez infekcję
bakteryjną
wady rozwojowe
- nadmierny ciężar okołourodzeniowy (2-3 razy)
- bardzo silne skrócenie żuchwy, bardzo duży język
- nieprzewidywalny rozwój łożyska
- zaburzenie układu immunologicznego, krążeniowego i oddechowego
zwierzęta transgeniczne - mają w swym genomie obcy gen (fragment DNA)
transgeneza - wprowadzenie funkcjonalnego materiału genetycznego (DNA) do komórek linii płciowej
(bo do komórek somatycznych to terapia genowa), wprowadzony materiał integruje się z
jądrem DNA i jest przekazywane następnym pokoleniom
1988r. - owca produkuje α-1-antytrypsynę, lek przeciw chorobom płuc i F-IX, lek przeciw hemofilii
1994r. - buhaj z genem laktoferyny człowieka (po to, aby dzieci pijące mleko były odporna na infekcje
bakteryjne)
transgen - rekombinowana cząsteczka DNA złożona z minimum dwóch elementów
- element regulatorowy - zapewnia specyficzność tkankową, jest nim promotor, kontroluje
miejsce ekspresji transgenu, modyfikuje wielkość tej ekspresji
- elemet strukturalny - sekwensja DNA kodująca informację genetyczną niezbędną do syntezy
produktu genowego (białka), zawiera egzony, introny
może być
- gen reporterowy - do detekcji ekspresji (lacZ, lucyferaza, GFP)
- wektor - cząsteczka DNA umożliwiająca wprowadzenie transgenu do org.
metody:
- mikroiniekcja DNA do przedjądrza (wprowadzenie genu, fragmentu DNA)
- bezpośrednia mikroiniekcja konstruktu genowego (transgen genu
lub kombinacji genów, do przedjądrzy, zapłodnienie oocytu,
wprowadzenie zapłodnionego oocytu do dróg rodnych biorczyni)
zalety i wady:
- prostota
- najczęstsza
- niewielka efektywność, trudno przewidzieć skutki
(losowa integracja z DNA komórki biorcy transgenu)
pobieranie embrionów (chirurgicznie)
mikroiniekcja transgenu
przeniesienie zarodka do bioczyni pseudocięzarnej
test - wykrycie transgenu PCR lub Southern
test - wykrycie ekspresji transgenu przez RT-PCR lub Blotting
synhronizacja hormonalna - dawczyie (superowulacja) i biorczynie (mogą być przyg. hormonalnie lub
kojarzone ze sterylnymi samcami)
2001r. - małpka ArD (rhezus)
- posiada w genotypie GFP
- elementem wprowadzającym wektor był wirus
- wykorzystanie nie zapłodnionych oocytów, później zapłodnione
- zastosowanie pierwotnych komórek zarodkowych ESC (wykorzystanie zdolności ich
do wzrostu w warunkach in vitro)
- transgen prowadzany do ESC, a następnie ESC do węzła zarodkowego)
- technika Cre-lox
- wprowadzanie transgenu za pomocą wirusa
- wirus ma tylko jeden cykl replikacyjny
- ograniczone zastosowanie (długość wprowadzanego DNA - 8kpz)
wydajność trangenezy
- królik 1-5%
- bydło 0,5%
- świnia 0,5-1%
- owca, koza 1-2%
średnia liczba komórek jajowych do uzyskania 1 zwierzęcia transgenicznego
- mysz 40
- świnia 100
- owca 110
- koza 90
- bydło 1600
cele
- zwierzęta jako żywe bioreaktory (produkowanie ludzkich białek, szczególnie tych, których niedobór
powoduje chorobę)
- albumina surowicy ludzkiej
- aktywator plazminogenu (rak okrężnicy)
- hemoglobina
- kolagen
- fibrynogen
- antytrombina III (skrzepy)
- interleukina-2 (stymulacja i proliferacja limfocytów T)
- α-antytrypsyna (rozedma)
- czynnik F-VIII, F-IX (hemofilia)
- laktoferyna (infekcje bakteryjne)
- doskonalenie produktów zwierzęcych
- poprawa cech użytkowości mlecznej
- hormon wzrostu
- CSN (poprawa termostabilniości mleka)
- α-laktoglobulina (zmiejsza zaw. laktozy)
- β-laktoglobulina (poprawia strawność)
- zastąpienie genów białek
- popraw tempa wzrostu mięsa i jakości mięsa
- minusem są wrzody żołądka, stan zapalny nerek,
zapalenia płuc, zmniejszenie płodności (to
konsekwencje zwiększenia hormonu)
- plusem jest mniejsze otłuszczenie tuszy i
zastosowanie mniejszej ilości paszy
- poprawa jakości i ilości wełny
-geny cysteiny i keratyny
- wzrost odporności na choroby
- odporność na bakterie (mastitis)
- lizozym u - przeciw mastitis
- gen kodujący glikoproteinową otoczkę wirusa (odporność między
innymi na AUL, leukoza ptasia)
- IFN - interferon (mniejsza podatność na grypę
- model zwierzęcy chorób człowieka (mysz)
- zwierzęcy trangen w toksykologii (zwierzęta testowe, wykrywanie toksyn)
- zwierzęcy transgen w biologii molekularnej (badanie regulatorów ekspresji genów umożliwia ocenę
genetyczną na poziomie całego organizmu)
- hormony rekombinacyjne (produkcja u bakterii, np somatotropiny) stosowane do wzrostu produkcji
mleka i mięsa
bariera ksenotransplantacji - nadostry odrzut przeszczepu
- odpowiedzialny jest za to disacharyd Gal α-1,3, on nie
ulega ekspresji u ludzi, natomiast u świni tak, (dlatego
trzeba produkować świnie bez tego genu)
plany: plemniki jako wektory