Propedeutyka biotechnologii - wykład 2
Cytometria przepływowa (FLOW CYTOMETRY) w rozrodzie zwierząt
rozdział nasienia na frakcję „męską” i „żeńską” (różnica między chromosomem X i Y w zawartości DNA)
ocena nasienia i badania nad spermatogenezą, analiza plemników pod kątem zdolności zapłodnienia
uzyskiwanie pierwotnych pęcherzyków jajnikowych
enzymatyczne trawienie tkanek jajnika
oddzielenie pęcherzyków od komórek somatycznych (sortowanie z użyciem cytometru)
segregacja plemników --> cytometr + sorter --> frakcja X i Y --------> zapłodnienie in vitro
- regulacja płci (w hodowli zwierząt)
- możliwość dysponowania większą liczbą samic
- wzrost efektów genetyczno-hodowlanych
- uzyskanie samców przeznaczonych na rzeż (bydło mięsne, krzyżowanie towarowe)
Wieloparametrowa cytometria --> barwienie komórek fluorochromem (ocena zawartości DNA) i zankowanie fluoresceiną przeciwciała monoklonalnego (MAb) w celu oceny ilości receptora estrogenu.
Heterogenność ekspresji receptora estrogenu (różne poziomy ekspresji).
Dwuparametrowa analiza zamrożonego nasienia bydła
barwienie jodkiem propydyny i carboxy....
Wykorzystanie immunofluorescencji do określenia subpopulacji limfocytów (CD4, CD8)
zastosowanie MAb
barwienie FITC
inkubowanie z przeciwciałami antyCD4 i anty CD8
Uwarunkowanie odpowiedzi owiec na nicienie
populacja limfocytów w krwi obwodowej owiec rasy wrzosówka
limfocyty CD8+ (cytotoksyczne/supresorowe)
limfocyty CD4+ (pomocnicze)
inkubujemy z Ab antyCD4, antyCD8, które pojawiają się w trakcie inwazji nicieni
- Limfocyty (CD2) i B(CD19) bydła
Uzyskiwanie MAb (monoklonalnych przeciwciał) - prdukcja przez limfocyty B, przeciwko określonemu antygenowi, potem tworzy się hybrydę z komórkami szpiczaka (nieśmiertelność i zdolność do ciągłej poliferacji) i ciągła produkcja Ab
immunizacja ---> komórki produkujace Ab ---> fuzja z komórkami rakowymi ---> hybrydy --->
--> produkcja przeciwciał
MAPOWANIE GENOMU
Genom
genetyczna informacja zawarta w pojedynczej gamecie
haploidalny zestaw chromosomów
zestaw loci obecnych w haploidalnym zestawie chromosomów
sekwencje kodujące [geny]
sewencje niekodujące [anonimowe sekwencje DNA: mikro- i minisaletilty etc.] wykorzystywane do lokalizacji nowych genów o nieznanej lokalizacji, kryminalistyka, medycyna sądowa, diagnostyka chorób genetycznych;
całkowita długość DNA: ok 3 mld pz
całkowita długośc genetyczna: 2500 - 3200 cM (1cM=1000pz)
człowiek i mysz mają podobną ilość genów
przy mapowaniu nie jest ważna liczba alleli danego genu ale ich lokalizacja w chromosomie
Organizacja genomu
sekwencje kodujące [geny] stanowią ok. 5%
sekwencje niekodujące stanowią ok. 95%
repetytywne sekwencje
minisatelity (5-20pz)
mikrosatelity(1-6pz)
elementy nukleotydowe [ LINE>500pz, SINE<500pz]
antycypacja odojcowska - jeżeli gen dziedziczony od ojca tym wcześniej się ujawnia!!!
Markery genetyczne
marker genetyczny -> każda dziedziczna cecha fizyczna czy molekularna
cechy markerów genetycznych:
polimorficzność
łatwość oznaczenia
zawartość informacji genetycznej
-> heterozygotyczność
-> PIC - plymorphism information content
- we wzorach na obydwie te cechy wykorzystujemy frekwencje
występowania poszczególnych alleli danego genu
Liczba genotypów w przypadku serii alleli wileokrotnych: [n(n+1)]
np. 3 allele ---> [3(3+1)] = 6
13 alleli ---> [13(13+1)] = 91 (locus transferyny u koni)
{ja nie kumam jak tej kobiecie te wyniki powychodziły, chyba ma inny kalkulator niż ja ;p}
[w USA - hormon wzrostu podawany zwierzętom w celu zwiększania ich wzrostu ;p]
MAS - marker asisstent selecting
Klasy markerów genetycznych
KLASA I |
KLASA II |
Kodujące sekwencje DNA (niektóre cechy jakościowe) |
Niekodujące sekwencje DNA |
- antygeny erytrocytarne (grupy krwi) - MHC - allotypy immunoglobulin - allotypy lipoprotein - białka polimorficzne osocza krwi i erytrocytów - białka polimorficzne mleka |
- minisatelitarny plomorfizm [VNTR] - mikrosatelitarny polimorfizm [STR] |
Fragmenty restrykcyjne DNA (RFLP) |
|
Identyfikacja: - metody serologiczne - metoda elektroforezy - metody biologii molekularnej |
Identyfikacja: - metody biologii molekularnej |
Polimorfizm alleli HLA:
Klasa I HLA |
Klasa II HLA |
||
Locus |
Liczba alleli |
Locus |
Liczba alleli |
A |
67 |
DRA |
2 |
B |
149 |
DRB |
272 |
C |
39 |
DQA |
20 |
E |
5 |
DQB |
36 |
F |
1 |
DPA |
13 |
G |
6 |
DPB |
82 |
|
|
DMA |
4 |
|
|
DMB |
5 |
Mapowanie genomu
identyfikacja ważnych genów
poznanie organizacji genomów różnych gatunków
badania porównawcze genomów różnych gatunków
zastosowanie markerów genetycznych w kontroli pochodzenia, kryminalistyce itd.
Markerowa mapa genomu
mapa fizyczna (cytogenetyczna) - odległość między loci w „pz” [bp]
mapa sprzężeniowa (genetyczna) - odległość między loci w cM
Odległość 1 cM odpowiada długości cząsteczki DNA liczącej około jednego miliona par zasad
(z dużym przybliżeniem) = cM to liczba crossing over na 100 mejoz
Mapa fizyczna-> barwienie prążkowe -> prążki numerowane i to numerowanie ułatwia podanie konkretnej lokalizacji danego genu.
Mapa sprzężeniowa - jest podziałka z odległościami, interesuje nas po to żeby okreslić które geny są sprzężone ze sobą.
Mapa genetyczna samicy jest zawsze dłuższa niż mapa genetyczna samca!!!!!!!!!!!!!!!
Crossing over zachodzi częściej w oocytach niż w plemniku.
Fizyczna odległość między loci - liczba par zasad między danymi loci........
Zmienność plemników wynika z ich liczby
Fizyczne mapowanie genomu
in situ hybrydyzacja (ISH) = hybrydyzacja na chromosomach
radioaktywna ISH
fluorescencyjna ISH (FISH)
FISH na chromatynie interfazowej
hybrydyzacja komórek somatycznych
badania rodzinowe kosegregacji genetycznych i cytogenetycznych markerów (CBG, Ag-NORs)
Hybrydyzacja in situ (ISH):
sonda DNA: klonowany lub amplifikowany (PCR) fragment DNA
znakowanie sondy przez inkorporację
radioaktywnie znakowanego nukleotydu (RISH)
zmodyfikowanego nukleotydu (biotin-11-dUTP) do fluorescencyjnej metody FISH
Procedura FISH:
hodowla komórkowa (limfocyty lub fibroblasty) --> utrwalenie komórek --> uwolnienie DNA z jąder komórkowych na preparacie mikroskopowym --> hybrydyzacja in situ sondami znakowanymi różnymi systemami np. Biotyna; --> dtekcja sygnału w mikroskopie (wielokolorowa hybrydyzacja in situ) --> ustalenie kolejności ściśle sprzężonych loci.
Rozdzielczość ISH na chromosomach :
a) metafazowych - 1Mb (1 mln pz)
b) interfazowych - 50 kb (50 tys pz)
hybrydyzacja in situ ISH
denaturacja chromosomów
denaturacja sondy
hybrydyzacja (sobda + chromosomy) 37 stopni C
detekcja sygnału hybrydyzowanego pod mikroskopem
identyfikacja chromosomu barwionego metodą prążków
GTG po hybrydyzacji
QFQ przed hybrydyzacją
DAPI równolegle z sygnałem hybrydyzacyjnym
(można w każdym momencie przeprowadzić barwienie prążków, ale na każdym z etapów używa się innych barwników)
hybrydyzacja in situ FISH
- oznaczanie płci genetycznej
fluorescencyjna hybrydyzacja in situ chromosomów człowieka z sondą telomerową (T2AG3)n [żółta] z sondą SRY[czerwona]
wykorzystanie - do diagnostyki mutacji chromosomowych, np.diagnostyka translokacji między chromosomem nr. 1 i nr. 4 człowieka
SRY - gen zlokalizowany w chromosomie Y ssaków
PRINS - stosowana aby wzmocnić sygnał sondy
Preprat mikroskopowy Eppendof
dATP, dGTP, dCTP
Denaturacja (92-94C) fluoresceina, taq polimeraza, sonda
Denaturacja (92-94C)
Hybrydyzacja in situ (na preparacie mikroskopowym)
Znakowane wydłużenie sondy na matrycy DNA chromosomu
Detekcja sygnału w mikroskopie
DISC-PCR
- naniesienie mieszaniny na preparat
- nałożenie szkiełka nakrywkowego
- PCR w preparacie mikroskopowym (np. 94C, 58C, 72C, 24 cykle)
- znakowana amplifikacja fragmentu DNA na chromosomie metafazowym, znajdującym sie na preparacie mikroskopowym
- detekcja sygnału w mikroskopie
Porównawcze malowanie chromosomów
ZOO-FISH; Comparative Chromosome Painting
Preparat mikroskopowy (bydło) sortowanie chromoomów w
Cytometrze przepływowym (człowiek)
Bariera QfQ (identyfikacja chromosomów) plazmidowa biblioteka chromosomu
Znakowanie sondy chromosomowej
Denaturacja denaturacja
Hybrydyzacja in situ
Detekcja sygnałów demonstrujących hybrydyzację
Pomiędzy danym chromosomem ludzkim a
Chromosomami bydlęcymi
- sondą molekularną jest każdy chromosom, a każdy z chromosomów jest wyznakowany innym barwnikiem fluorescencyjnym; (w tej metodzie)
W cytometrze przepływowym następuje sortowanie chromosomów.
Mapy porównawcze pomiedzy różnymi gatunkami pozwalają na łatwiejszą identyfikację czy lokalizację genów odpowiedzialnych za np.jakieś choroby.
Metoda porównawczej hybrydyzacji genomów
(CGH - comparative genomic hybridization) analiza aberracji chromosomowych w chorobach nowotworowych.
DNA z guza DNA referencyjny (z prawidłowych
(znakowany na zielono) komórek dawcy tej samej płci co chory
(znakowany na czerwono)
hybrydyzcja
kolekcjonowanie trzech obrazów (w kolorze zielonym, czerwonym
i niebieskim, dobrawianie chromosomów DAP w celu późniejszego
rozpoznawania poszczególnych chromosomów
ułożenie kariotypu
analiza stosunkufluoescecji czerwonej do zielonejna całej
długości chromosomów
Hybrydyzacja komórek somatycznych - SCH
fuzja komórek (limfocytów lub fibroblastów) od gatunku badanego z nieśmiertelnymi komórkami linii nowotworowych (komórki gryzoni)
selekcja komórek hybrydowych
gubienie chromosomów gatunku badanego
biochemiczna analiza klonów
identyfikacja genów syntenicznych
lokalizacja grup syntenicznych w chromosomie !!!
- klony gubią chromosomy badanego gatunku
- grupy synteniczne identyfikujemy na poziomie białka
Grupy Synteniczne i Sprzężeniowe:
synteniczne
loci na tym samym chromosomie
identyfikacja za pomocą metody hybrydyzacji komórek somatycznych
odległości miedzy loci i ich kolejność nieznana
sprzężeniowe
loci na tym samym chromosomie
identyfikacja poprzez analizę segregacji markerów w rodzinach referencyjnych
odległości między loci sprzężonymi i ich kolejność może być określona
Genetyczna mapa genomu - mapa sprzężeniowa
Tworzona na podstawie analizy segregacji alleli w loci markerowych u potomstwa osobników o znanych genotypach.
poszukiwanie sprzężeń między loci
na podstawie liczby zidentyfikowancyh rekombinantów, szacowanie odległości genetycznych [cM] między sprzężonymi loci
uszeregowanie sprzężonych loci (pomocna tzw krzyżówka trzypunktowa)
wykrywanie sprzezeń
- funkcje zwane logarytmem (funkcja ''lod'' = logarytm ilorazu wiarygodności)
wartość lod>3 (analizowane loci są ze sobą sprzężone)
wartość lod<2 (analizowane loci nie są ze sobą sprzężone)
wartość 2-3 (niemożność wyciągnięcia jednoznacznego wniosku
funkcja Kasambiego (x) - odległość genetyczna między sprzężonymi loci, jest to funkcja względna, dwie okoliczności wpływające na częstość identyfikowanych zjawisk crossing-over
- występowanie podwójnego crossing-over
- proces interferencji
Projekty mapowania genomów
- PIG Map
-Bov Map
- Dog Map (pies, Polska też)
- współpraca krajów skandynawskich (mapa genowa świni)
- Equine Genome Mapping Project (konia, Polska)
Mapowanie radiacyjne- zmodyfikowana metoda hybrydyzacji komórek somatycznych
- komórki gatunku mapownego naśietlane promieniowaniem X (fragmetacja
chromosomów)
- hybrydyzacja komórek naśnikowych (np. komórki nowotworowe myszy)
- fuzja fragmentów chromosomów z chromosomami
- wychwycenie bardzo blisko położonych loci, tak że mapowanie
genetyczne jest możliwe