Biokatalizatory unieruchomione
Techniczne wykorzystanie enzymów w ich naturalnej (natywnej) formie napotyka zasadnicze trudności związane z kosztem ich otrzymywania i niemożnością wielokrotnego użycia. Enzymy bowiem, jako białka rozpuszczalne w wodzie, są trudne do wydzielenia z mieszaniny poreakcyjnej, a poza tym łatwo ulegają natywacji. Enzymy rozpuszczalne stosowane są obecnie w niektórych tylko technologiach przemysłowych (np. hydroliza skrobi, synteza dekstranu), w procesach laboratoryjnych (np. liza ściany komórkowej, manipulacje z materiałem genetycznym) oraz w analityce (np. oznaczanie glukozy). Duża część produkowanych enzymów (proteazy, lipazy) stosowana jest w formie rozpuszczalnej w środkach piorących. Jednorazowe użycie enzymu jest możliwe jedynie wówczas, gdy jest on stosowany w małych ilościach (analityka, prace laboratoryjne) lub gdy jest produkowany tanio i w dużych ilościach (proteazy, amylazy).
Wprowadzanie enzymów do technologii przemysłowych na szerszą skalę stało się możliwe dzięki opracowaniu metod immobilizacji, głównie na drodze wiązania ich nierozpuszczalnymi nośnikami. Pierwsze procesy przemysłowe z użyciem unieruchomionych enzymów wprowadzono w latach sześćdziesiątych. Równolegle opracowywano technikę hodowli komórek zwierzęcych na nośnikach mechanicznych oraz unieruchamianie komórek drobnoustrojów w matrycach żelowych. W latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych nastąpił dynamiczny rozwój metod unieruchamiania oraz pojawiło się wiele nowych propozycji technologii z użyciem biokatalizatorów unieruchomionych. Należy jednak w tym miejscu zaznaczyć, że pierwszą technologią przemysłową, w której zastosowano złoże biokatalizatora unieruchomionego, była mikrobiologiczna produkcja octu. Rozwijana od XVII w., opracowana ostatecznie na początku XX w. technologia polega na wykorzystaniu samoodnawialnego złoża komórek bakterii kwasu octowego zaadsorbowanych na materiale roślinnym, najczęściej na wiórach bukowych. Złoża biologiczne z unieruchomioną biomasą od ponad stu lat wykorzystywane są również w technologii oczyszczania ścieków. Immobilizacja biokatalizatorów nie została wymyślona przez człowieka. W przyrodzie procesy enzymatyczne i mikrobiologiczne przebiegają od milionów lat przy udziale enzymów i komórek związanych w sposób naturalny z rozpuszczalnymi lub nierozpuszczalnymi matrycami oraz nośnikami mechanicznymi. W ten sposób drobnoustroje kolonizują środowiska swojego rozwoju wykorzystując naturalne procesy adhezji. Również enzymy działają w większości w stanie związanym ze strukturami subkomórkowymi. Zapewnia im to funkcjonalną lokalizację oraz stabilizację ich aktywności. Enzymy rozpuszczalne występują w określonych przedziałach (kompartmentach) komórki, a więc są one także w pewnym sensie unieruchomione, natomiast wydzielone z komórki do środowiska funkcjonują często po związaniu się z wielkocząsteczkowymi substratami. Duża część procesów komórkowych zachodzi przy udziale kompleksów wieloenzymowych. Ten duży wachlarz naturalnych rozwiązań procesów biokatalizy w przyrodzie jest obecnie odtwarzany w technice. Technologia wytwarzania jest naśladownictwem i rozwinięciem procesów naturalnych.
Metody unieruchamiania
W początkowym okresie rozwoju technik unieruchamiania enzymów terminem "immobilizacja" określano przeprowadzenie enzymu ze stanu rozpuszczalnego do nierozpuszczalnego, najczęściej przez związanie go z mechanicznym nośnikiem, Obecnie w definicji biokatalizatorów unieruchomionych podkreśla się możliwość ich powtórnego (wielokrotnego) użycia, niezależnie od rozwiązań technicznych, które to umożliwiają. Można to osiągnąć metodami fizycznymi lub chemicznymi przez związanie enzymów, komórek lub organelli subkomórkowych na powierzchni nośnika lub w jego wnętrzu, jak też poprzez umiejscowienie ich w określonej przestrzeni np. w bioreaktorze, bez użycia mechanicznych nośników.
W miarę rozwoju nowych procesów biokatalizy zanikają wyraźne początkowo granice pomiędzy biokatalizatorami natywnymi i immobilizowanymi. Obecnie opracowywane są procesy mikrobiologiczne w bioreaktorach z membranami filtracyjnymi, procesy z separacją biomasy na drodze sedymentacji lub wirowania i zawracaniem jej w celu ponownego użycia. Enzymy wiązane są również z rozpuszczalnymi polimerami wielkocząsteczkowymi w celu umożliwienia wydzielenia ich lub zamknięcia w bioreaktorze przy użyciu techniki ultrafiltracji. Komórki można "unieruchomić" stosując ciekłe układy wielofazowe, m.in. dwufazowe układy wodne. Użycie dwóch mieszających się z wodą, ale nie mieszających się ze sobą polimerów, np. glikolu polietylenowego i dekstranu, umożliwia łatwe wydzielanie komórek w wodnej warstwie dekstranowej po przerwaniu mieszania układu. Substraty i produkty o właściwościach hydrofobowych znajdują się w wodnej warstwie glikolu polietylenowego. W warunkach intensywnego mieszania uzyskuje się bardzo dobre rozproszenie obu faz i efektywną przemianę substratu. Te i inne specjalne techniki biokatalizy nie będą tutaj szczegółowo omawiane. Przytoczone zostaną jedynie podstawowe, klasyczne sposoby unieruchamiania enzymów i komórek, polegające na ich wiązaniu wewnątrz lub na powierzchni nośników nierozpuszczalnych.
Metody unieruchamiania biokatalizatorów:
1. Wiązanie na powierzchni nośnika
1.1. Adsorpcja i adhezja dzięki siłom jonowym, wiązaniom wodorowym i innym słabym oddziaływaniom fizykochemicznym. Przykłady nośników: drewno, celuloza, jonity (Sephadex, DEAE-celuloza, CM-celuloza), polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, krzemionka, szkło porowate, ceramika, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny, koks.
1.2. Wiązania kowalencyjne, takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot i inne.
Nośniki i odczynniki wiążące: hydroksyalkilometakrylan + aldehyd glutarowy, karboksymetyloceluloza + karbodiimid, szkło lub ceramika po uaktywnieniu 3-aminopropylotrietoksykrzemianem + aldehyd glutarowy; inne odczynniki wiążące i aktywujące: diaminy, kwasy dikarboksylowe, bezwodniki kwasowe, bromocyjan, izomocznik.
2. Wiązanie w matrycy nośnika
2.1. Pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych. Przykłady nośników: agar, alginian, karagenan, kolagen, poliakryloamid, poliuretan, polistyren, żywice sieciowane energią świetlną.
2.2. Pułapkowanie we włóknach. Najważniejszym przykładem są tu włókna z octanu celulozy.
3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych
3.1. Zamykanie w komórkach naturalnych, np. w erytrocytach.
3.2. Kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: liposomy, kapsułki nylonowe, kolodionowe, polimocznikowe, z pochodnych celulozy.
3.3. Zamykanie pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych - nylonowych, silikonowych i innych.
4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego
4.1. Sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych (jak w p. 1.2.).
4.2. Flokulacja komórek przy udziale polielektrolitów.
4.3. Samoagregacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów (grzybów, promieniowców) w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy. Często bywa celowe łączenie dwóch różnych metod unieruchamiania. Przykładowo, kuleczki grzybni można poddać działaniu czynników chemicznych (aldehyd glutarowy) lub fizycznych (podwyższona temperatura) . Adsorpcję enzymów lub komórek na nośnikach można łączyć z sieciowaniem, co daje układ znacznie trwalszy mechanicznie i ogranicza wymywanie biokatalizatora ze złoża.
Analizując możliwość praktycznego zastosowania poszczególnych metod unieruchamiania można stwierdzić, że metoda adsorpcyjna jest łatwa i tania, ale wykorzystuje nietrwałe układy, w których zachodzi wymywanie biokatalizatora ze złoża; wiązanie kowalencyjne z nośnikiem jest również łatwe do wykonania, dające przy tym układ stabilny, ale drogie; pułapkowanie w żelu jest tanie, ale nie można go stosować do enzymów hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe (utrudniona dostępność) oraz mogących degradować żel; kapsułkowanie, szczególnie cenne w lecznictwie, jest trudne do przeprowadzenia i kontroli oraz może mieć zastosowanie wyłącznie w odniesieniu do przemian substratów małocząsteczkowych; wzajemne sieciowanie - łatwe i tanie, zapewnia dużą aktywność i stabilność chemiczną (ale nie mechaniczną), zalecane raczej do procesów z użyciem substratów małocząsteczkowych.
Charakterystyka technologiczna biokatalizatorów unieruchomionych
Analizując aktywność biologiczną można wyróżnić pięć podstawowych typów biokatalizatorów unieruchomionych :
1. Preparaty pojedynczych enzymów katalizujących proste reakcje biochemiczne, np. hydrolizę, kondensację, czy izomeryzację.
2. Kompleksy dwóch lub więcej enzymów, umożliwiające prowadzenie reakcji bardziej złożonych, np. utleniania połączonego z regeneracją kofaktorów.
3. Całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowych, często ze wstępną obróbką pozwalającą na zwiększenie transportu substratów i produktów przez błonę komórkową.
4. Żywe komórki z zachowaniem i wykorzystaniem ich aktywności metabolicznej; często również zdolności do rozmnażania; układy takie stosowane są zarówno w odniesieniu do komórek drobnoustrojów, jak i komórek zwierzęcych in vitro.
5. Struktury subkomórkowe (organelle) z zachowaną aktywnością do przeprowadzenia określonych procesów, często wieloetapowych.
Stosowanie enzymów rozpuszczalnych ma wiele niedogodności. Enzymy takie są mało stabilne, szczególnie w podwyższonej temperaturze, nie można ich stosować w środowisku w rozpuszczalnikami organicznymi, trudno jest je wydzielić z mieszaniny poreakcyjnej w celu powtórnego użycia, co podraża technologie opierające się na ich stosowaniu.
W odróżnieniu od tego enzymy unieruchomione mają wiele zalet, takich jak:
l) możliwość wielokrotnego użycia lub wykorzystania w procesach ciągłych,
2) prosta technologia i aparatura do procesów z ich użyciem,
3) łatwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej, 4) przedłużona stabilność katalityczna enzymu,
5) obniżone koszty technologiczne procesów z ich użyciem.
Dalsze zalety odnoszą się do biotechnologii realizowanych z użyciem unieruchomionych komórek; należy tu wymienić:
1) pominięcie kosztownych i pracochłonnych metod izolacji i oczyszczania białek enzymatycznych,
2) zachowanie wyższej reaktywności i stabilności enzymów,
3) możliwość prowadzenia procesów bardziej złożonych, np. wymagających regeneracji kofaktorów,
4) większa oporność na działanie czynników
5) możliwość zwiększenia gęstości zawiesiny
Tempo procesów realizowanych z użyciem komórek unieruchomionych można znacznie zwiększyć, w porównaniu z szybkością procesów przebiegających w klasycznej hodowli drobnoustrojów, przez wyeliminowanie bariery przepuszczalności błony komórkowej dla substratów i produktów przemiany. Uzyskuje się to w wyniku specjalnej obróbki komórek czynnikami naruszającymi strukturę błony komórkowej. Zależnie od rodzaju procesu, w którym unieruchomione komórki mają być użyte, stosuje się np. substancje powierzchniowo czynne, zamrażanie i odmrażanie, ogrzewanie do temperatury powyżej 50°C, a także częściową autolizę komórek.
Związanie komórek z nośnikiem przyczynia się do większego ich namnożenia bez wzrostu gęstości i lepkości hodowli, dzięki czemu uzyskuje się korzystne warunki przenikania tlenu z fazy gazowej do wodnej. Jest to ważny problem technologiczny, bowiem duża lepkość i gęstość są czynnikami ograniczającymi szybkość tlenowych procesów mikrobiologicznych.
Unieruchomione biokatalizatory wymagają zazwyczaj uaktywnienia. W tym celu stosuje się najczęściej inkubację w roztworze substratu. W wypadku żywych komórek stosuje się inkubację w podłożu wzrostowym z dodatkiem odpowiednich induktorów.
W czasie procesu złoże biokatalizatora stopniowo traci swoją produktywność, co spowodowane jest:
1) wymywaniem enzymu lub komórek ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem złoża,
2) utratą aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu bądź lizy komórek,
3) pogorszeniem się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się złoża oraz zmiany charakterystyki przepływu substratu,
4) trudnościami związanymi z użyciem zawiesin i klasycznych kompleksowych podłoży fermentacyjnych,
5) zakażeniami mikrobiologicznymi, które mogą wystąpić szczególnie w przypadku użycia roztworu reakcyjnego zawierającego składniki umożliwiające rozwój drobnoustrojów.
Biokatalizatory unieruchomione charakteryzowane są pod kątem kinetyki procesów, w których uczestniczą, oraz warunków technologicznych koniecznych do optymalnego przebiegu procesu biokatalizy. Podstawowym parametrem technologicznym jest tu stabilność operacyjna, określana jako czas pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora. Parametr ten dla wielu układów wynosi kilka do kilkudziesięciu dób. Do wyjątkowo stabilnych preparatów należą unieruchomione w żelu karagenowym komórki E.coli z aktywną aspartazą, katalizującą syntezę kwasu asparaginowego z kwasu fumarowego i amoniaku; operacyjny okres połowicznej utraty przez nie aktywności w warunkach przemysłowych wynosił blisko dwa lata.
Jednym z pierwszych procesów przemysłowego użycia unieruchomionego enzymu było otrzymywanie L-aminokwasów z chemicznej mieszaniny acetylo-DL-aminokwasów. Stosując bioreaktor kolumnowy ze złożem L-aminoacy1azy (objętość złoża l m3), japońska firma Tanabe Seiyaku Co (Osaka), uruchomiła w roku 1969 ciągły proces produkcji L-aminokwasów.
Unieruchomione enzymy i komórki znajdują obecnie coraz szersze zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu chemicznego, farmaceutycznego i spożywczego, w których stosowane są m.in. do: hydrolizy dwucukrów, otrzymywania fruktozy, kwasów organicznych, aminokwasów, antybiotyków i nukleotydów, do stabilizacji piwa, wina i soków owocowych, a także do degradacji zanieczyszczeń.
6