Testy biodegradacji

Prowadzone są w celu określenia podatności związków chemicznych i ich mieszanin na mikrobiologiczny rozkład.

Brak rozkładu - związki są odporne na biodegradację lub toksyczne dla mikroorganizmów

Łatwa rozkładalność - obecność takiego związku w mieszaninie może hamować rozkład innych na skutek prawie wyłącznego żywienia się przez mikroorganizmy tym związkiem i nie pobieraniu pozostałych

W procesach biodegradacji pojawiają się często produkty pośrednie toksyczne dla mikroorganizmów lub inhibitujące dalsze przemiany

Rozkład wielu związków zachodzi w drodze kometabolizmu - jeden związek stanowi rzeczywiste źródło węgla i energii, a drugi rozkładany jest „przy okazji”

Badania biodegradacji zanieczyszczeń służą do:

• atestacji związków chemicznych i innych wyrobów

• wyznaczania dopuszczalnych stężeń zanieczyszczeń w środowisku

• prognozowania możliwości biorozkładu w środowisku

• prognozowania możliwości usuwania zanieczyszczeń na drodze biologicznej ze ścieków i wód uzdatnianych dla celów spożywczych

Polegają one na określeniu przebiegu rozkładu testowanego związku organicznego przez mikroorganizmy, dla których stanowi on jedyne źródło węgla i energii

Sposób wykonania testu zależy od celu któremu ma on służyć:

• badanie rozkładu związku w wodach powierzchniowych pod kątem samooczyszczania wód: małe stężenia związku i niewielkie zaszczepienie

• badanie podatności związku na rozkład biologiczny w procesie oczyszczania ścieków: duże stężenia związku, duże zaszczepienie

• określenie podatności na biodegradację związku na składowisku odpadów, w osadach dennych zbiorników wodnych itp.: warunki beztlenowe, średnie lub duże zaszczepienie

Środowisko dla testów: woda lub gleba

Wytyczne wykonywania testów - różne organizacje, np.:

• najczęściej OECD (Section 3: Degradation and Accumulation: http://www.oecd.org/document/57/0,3343,en_2649_34377_2348921_1_1_1_1,00.html)

• krajowe Zał. do rozp. Ministra Zdrowia z dnia 28 lipca 2003 roku (Dz. U. Nr 232 poz. 2343) METODY PRZEPROWADZANIA BADAŃ WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH, TOKSYCZNOŚCI I EKOTOKSYCZNOŚCI SUBSTANCJI I PREPARATÓW CHEMICZNYCH

• normy EN / ISO, np.: ISO 9439:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium -- Carbon dioxide evolution test

Badania w wodzie

Wg. OECD (sekwencja testów)

• testy przesiewowe

• potwierdzające

• symulacyjne

Testy przesiewowe:

• niewielkie zaszczepienie i niespecyficzne metody oceny postępu procesu

Związek jest biodegradowalny: jeżeli w czasie 28 dni nastąpi eliminacja RWO w 70 %, BZT w 60 % lub wytworzone zostanie 60 % CO₂ ;

Testy potwierdzające:

badania dłuższe i specyficzne metody kontroli ubytku; jeżeli rozkładowi ulegnie 20 % substancji to wstępnie uznaje się że jest ona biorozkładalna

Testy symulacyjne:

najczęściej w laboratoryjnych reaktorach imitujących moduł biologiczny oczyszczalni ścieków, kompostowników, komór fermantacyjnych

Oprócz testów biodegradowalności OECD podaje też testy bioakumulacji, np. związków lipofilnych (tłuszczolubnych charakteryzujących się dużymi wartościami współczynniku podziału oktanol/woda)

Nieco inne postępowanie proponuje Grady: C.P.L. Grady, Biodegradation: its measurement and microbiological basis, Biotechnology and Bioengineering 27 (1985), pp. 660-674

• testy wstępne w podłożu mineralnym z użyciem mikroorganizmów nie zaadoptowanych

• testy pośrednie w podłożu z dodatkowym węglem z użyciem mikroorganizmów zaadoptowanych do rozkładu badanego związku

• testy ostateczne w podłożu mineralnym z użyciem mikroorganizmów zaadoptowanych

• symulacyjne

Badania w środowisku glebowym

Przewiduje je m.in. OECD w środowisku gleb: piaszczystych kwaśnych, gliniastych słabo kwaśnych, obojętnych lub zasadowych

Czynniki limitujące biodegradowalność

• budowa związku i wynikające z niej właściwości fizyko-chemiczne

• skład podłoża (środowiska rozwoju): w tym:

• skład podłoża mineralnego

• obecność innych źródeł węgla

• odczyn podłoża

• stężenie substancji

• stężenie tlenu po warunki beztlenowe

• temperatura i naświetlenie

Elementy struktury związku wpływające na biodegradowalność

• rozgałęzienia łańcucha związku organicznego

• czwartorzędowy atom węgla

• grupy izopropylowe na końcu łańcucha

• liczba wiązań podwójnych i ich wzajemne usytuowanie

• podstawniki: halogenowe, nitrowe i nitrozowe, cyjanowe, aminowe

• podstawniki metylowe, hydroksylowe, halogenowe na pierścieniu aromatycznym

• liczba pierścieni aromatycznych i ich wzajemne usytuowanie

• heteroatomy w cząsteczce

• budowa cykliczna

• budowa polimerowa

• wiązania epoksydowe

Jak zwiększyć efektywność biodegradacji

Poprzez wykorzystanie synergicznego działania różnych organizmów szczepiąc podłoże mieszaną kulturą mikroorganizmów pobranych z naturalnych biocenoz poddawanych działaniu substancji które chcemy rozłożyć

Poprzez zaadoptowanie mikroorganizmów do danych związków; mają one czas na wytworzenie enzymów indukowanych. Proces ten można wspomagać dodając odpowiednio dobrane mikroelementy i witaminy oraz inne aktywatory enzymów

Niespecyficzne mierniki postępu biodegradacji

• ChZT - chemiczne zapotrzebowanie tlenu; ilość mg tlenu / dm³ cieczy koniecznego dla utlenienia w zdefiniowanych warunkach badanego związku

• BZT - biologiczne zapotrzebowanie tlenu; ilość mg tlenu / dm³ cieczy zużytego w określonym czasie (najczęściej 5 dób) przez mikroorganizmy

• RWO - rozpuszczalny węgiel organiczny; mg związku org. przeliczone na C / dm³

• wytworzony CO₂ - ilość dwutlenku węgla wytworzona w wyniku rozkładu testowanej substancji w czasie trwania pomiaru; mg O₂ / mg substancji

Dla oceny postępu biodegradacji tlenowej poprzez pomiar ilości wydzielonego CO₂ konieczne jest wyznaczenie (obliczenie) ilości tlenu niezbędnego dla całkowitego utlenienia substancji. Teoretyczne zapotrzebowanie tlenu - TZT - można obliczyć posługując się równaniem chemicznym procesu utleniania lub gotowymi wzorami. Obliczmy obiema metodami TZT dla glikozy (C₆H₁₂O₆), sacharozy (C₁₂H₂₂O₁₁), glicyny (C₂H₅O₂N), standardowego ścieku (C₄₄H₈₅O₂₁N₇)

Produktami mikrobiologicznego utleniania związków organicznych zawierających węgiel, wodór, tlen i azot są odpowiednio: CO₂, H₂O, NH₃

Wzór ogólny dla takiego utleniania:

C_cH_hO_oN_n + (c+(h - 3n)/4 - o/2)O₂ → c CO₂ + (h - 3n)2 H₂O + n NH₃

Metodyki badania postępu biodegradacji celem odniesienia uzyskanych wyników w konkretnym teście do standardowej sytuacji przewidują użycie w tym celu substancji porównawczych. Często wykorzystuje się w tym celu anilinę, octan sodu, benzoesan sodu, kwas cytrynowy, kwas adypinowy, 3-nitrofenol, dodecylosulfonianu i in. Jak różne wyniki można uzyskać w poszczególnych testach i jak one różnią się między sobą ukazuje poniższa tabela.

Związek	Test OECD	Test zamkniętych butelek	Test MITI	Test STURMA	Test AFNOR	Test Zahn- Wellens
	% O2	% TZT	% TZT	% CO2	% O2	% O2
anilina	93	90	99	92	-	100
2-chloro-anilina	0	0	0	0	-	94
kwas cytrynowy	100	90	0	97	100	85
kwas adypinowy	96	83	92	91	-	100
3-nitro-fenol	95	2	56	60	98	84
dodecylo-sulfonian	100	85	70	82	100	97

Klasyfikacja biodegradowalności:

	łatwo rozkładalny	rozkładalny	oporny
% przemiany	> 80	> 60	< 20

Podatność na biodegradowalność w środowisku wodnym często wyrażana jest stosunkiem BZT₅ do ChZT oraz spadkiem ChZT

BZT5 / ChZT	Spadek ChZT	Klasa
> 0,5	> 90	łatwo rozkładalny
0,4-0,5	50-90	rozkładalny
0,2-0,4	10-50	słabo rozkładalny
< 0,2	< 10	oporny

Podatność na biodegradowalność może być też wyrażona czasem półtrwania rozkładu τ_1/2 , czyli czasem niezbędnym dla rozłożenia

50 % początkowej ilości substratu. Dla reakcji I rzędu jest on niezależny od stężenia, a dla reakcji innych rzędów zależy od stężenia początkowego

Wyniki badań biodegradowalności i toksyczności substancji chemicznych pozwalają na zakwalifikowanie ich do odpowiedniej klasy podawanej w kartach charakterystyki substancji i innych dokumentach

8

---