Anna Michalak

Grupa 036 OSDM (A)

Sprawozdanie

Aminokwasy i białka

Celem ćwiczeń jest wykrywanie aminokwasów i białek dzięki znajomości reakcji charakterystycznych, reakcji barwnych i szeregu reakcji chemicznych umożliwiających zidentyfikowanie poszczególnych aminokwasów i białek.

Do tego celu posłużą nam reakcje:

• Reakcja Sörensena z aldehydem mrówkowym

• Reakcja z ninhydryną

• Reakcja cystynowa - wykrywanie cysteiny i cystyny

• Wykrywanie metioniny metodą McCarthy-Sullivana

• Reakcja z nitroprusydkiem sodu - wykrywanie grup tiolowych

• Reakcja ksantoproteinowa - wykrywanie aminokwasów aromatycznych

• Reakcja Millona - wykrywanie tyrozyny

• Reakcja Adamkiewicza - Hopkinsa - wykrywanie tryptofanu

• Reakcja Voiseneta - wykrywanie tryptofanu

• Reakcja Sakaguchi'ego - wykrywanie argininy

• Reakcja biuretowa (Piotrowskiego)

• Denaturacja cieplna

• Działanie etanolu

• Działanie stężonego HNO₃ (odczyn Hellera)

Reakcja Sörensena z aldehydem mrówkowym:

Reakcja ta służy do ilościowego oznaczenia aminokwasów.

Aminokwasy w wodnych roztworach mają charakter soli wewnątrzcząsteczkowych dzięki wzajemnemu zobojętnianiu się grup ά - aminowej i ά - karboksylowej. Nie mogą być one zatem miareczkowane zasadami, gdyż zakończenie miareczkowania zachodzi dopiero przy pH około 12. Dlatego też proces miareczkowania przeprowadza się w obecności aldehydu mrówkowego, dzięki czemu następuje obniżenie wartości pH do około 9 i w związku z tym końcowy punkt miareczkowania przesuwa się na zakres zmiany barwy fenoloftaleiny. Pozwala to na stosowanie tego wskaźnika przy miareczkowaniu aminokwasów roztworami zasad w obecności aldehydu mrówkowego.

mrówkowego doświadczeniu użyto w jednej probówce roztwór glicyny, dodano kilka kropli fenoloftaleiny i roztwór NaOH. Powstało lekko różowe zabarwienie. Do drugiej probówki dodano roztwór formaldehydu, kilka kropel fenoloftaleiny i roztwór NaOH. Również powstało lekko różowe zabarwienie. Następnie zmieszano oba roztwory ze sobą. Obserwuje się odbarwienie roztworu świadczące o zablokowaniu grup aminowych. Następnie miareczkowano roztworem NaOH do momentu pojawienia się różowego zabarwienia.

Dzięki temu można obliczyć zawartość glicyny w roztworze (ilościowe oznaczanie aminokwasów)

Reakcja z ninhydryną:

Reakcja ta służy do ilościowego oznaczenia aminokwasów.

Do roztworu gliceryny dodano roztwór ninhydryny i ogrzewano. Pod wpływem ogrzewania aminokwasy ulegają dekarboksylacji i oksydacyjnej deaminacji. Powstaje uboższy o jeden atom węgla aldehyd i wydziela się amoniak i CO₂. Następuje redukcja ninhydryny i zredukowana ninhydryna wchodzi w reakcje kondensacji z nadmiarem ninhydryny niezredukowanej i amoniakiem i w ostateczności otrzymujemy związek o zabarwieniu niebiesko - fiołkowym

Reakcja cystynowa - wykrywanie cysteiny i cystyny:

Reakcja ta słuzy do wykrywania cysterny i cystyny.

Do roztworu cystyny i cysterny dodano NaOH i ogrzewano. Pod wpływem alkaliów od cystyny i cysterny odczepia się siarka, która przechodzi do roztworu w postaci jonów siarczkowych S^2- Jony te identyfikujemy dodając siarczek ołowiu PbS, który po dodaniu do roztworu i ogrzaniu powoduje wytrącenie się czarnego osadu. Intensywniejszy osad powstał o probówce, w której znajdowała się cystyna.

Wykrywanie metioniny metodą McCarthy-Sullivana

Siarka zawarta w cząsteczkach metioniny jest odporna na działanie alkaliów.

Przygotowuje się dwie próby. Do pierwszej dodaje się metioninę, roztwór NaOH, 3 krople nitroprusydku sodu i roztwór glicyny. Do drugiej probówki natomiast dodajemy zamiast metioniny wodę destylowaną, roztwór NaOH, 3 krople nitroprusydku sodu i roztwór glicyny. Jest to tzw. próba ślepa. W próbie ślepej zaobserwowano zabarwienie żółtozielone, natomiast natomiast próbce z metioniną zabarwienie różowobrunatne nasilające się w ciągu kilku minut, świadczące o obecności metioniny.

Reakcja ksantoproteinowa - wykrywanie aminokwasów aromatycznych:

Reakcja ta umożliwia wykrywanie aminokwasów aromatycznych. Do roztworu tyrozyny dodajemy stężony HNO₃ i ogrzewamy. Pod wpływem ogrzewania tworzą się żółto zabarwione pochodne nitrowe, które po dodaniu NaOH zabarwiły się na pomarańczowo.

Reakcja Millona - wykrywanie tyrozyny

Reakcja ta umożliwia wykrycie tyrozyny. Do roztworu tyrozyny dodano kilka kropel odczynnika Millona i ogrzano. Pojawiła się czerwona barwa. Zabarwienie to pochodzi od kompleksu rtęciowo - fenolowo - nitrozowego.

Reakcja Adamkiewicza - Hopkinsa - wykrywanie tryptofanu:

Reakcja służy do wykrywania tryptofanu. W doświadczeniu użyto 1 cm³ tryptofanu. Do tego dodano stężonego kwasu octowego i odwarstwiono stężonym H₂SO₄ Na granicy zetknięcia obu płynów powstał fiołkowy pierścień.

Reakcja Voiseneta - wykrywanie tryptofanu

Reakcja ta umożliwia wykrycie tryptofanu. W doświadczeniu użyto roztwór tryptofanu, do tego dodano roztwór aldehydu mrówkowego i stężony HCl. Po 5 minutach dodano kroplami roztwór azotanu (III) sodu. Powstało fiołkowe zabarwienie świadczące o obecności tryptofanu.

Reakcja Sakaguchi'ego - wykrywanie argininy:

Reakcja ta służy do ilościowego oznaczania argininy. W doświadczeniu użyto 1 cm³ argininy, dodano NaOH, kilka kropli ά - naftolu i na końcu dodano wody bromowej i powstała barwa różowopomarańczowa. Wniosek z przebiegu analizy jest taki, iżw cząsteczkach argininy obecna jest reszta guanidynowa. W środowisku zasadowym i w obecności bromianu sodu jako środka utleniającego pochodne guanidyny reagują z ά - naftolem tworząc produkt o barwie różowopomarańczowej.

Reakcja biuretowa (Piotrowskiego):

Reakcja ta jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych występujących w cząsteczkach białek i peptydów. W doświadczeniu użyto w jednej probówce roztwór jaja kurzego, a w drugiej roztwór albuminy. Do roztworów tych dodano NaOH a także CuSO₄ . W probówce a jajem kurzym powstało fiołkowe zabarwienie, zaś w probówce z albuminą niebieskie. Wniosek z przebiegu analizy jest taki, iż w środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja wiązań peptydowych z wytworzeniem formy enolowej. Z ugrupowaniem tego typu jony miedzi Cu²⁺ tworzą dwa wiązania kowalencyjne z atomami tlenu grup enolowych i cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje połączenie kompleksowe o zabarwieniu fiołkowo niebieskim. Intensywność zabarwienia wykorzystywana jest w ilościowym oznaczeniu białka metodą kalorymetryczną.

Denaturacja cieplna:

Celem procesu denaturacji jest spowodowanie nieodwracalnych zmian w strukturze cząsteczek białka i zniszczenie struktur wyższego rzędu. W wyniku koagulacji następuje wytrącenie się białka z roztworu.

W doświadczeniu użyto w jednej probówce roztwór jaja kurzego zaś w drugiej probówce roztwór albuminy. Do obu roztworów dodano kilka kropel kwasu octowego ogrzano do wrzenia. W obu probówkach wytrącił się biały osad, który stał się obfitszy po dodaniu NaCl.

Wniosek z przebiegu analizy jest taki, iż pod wpływem odpowiednich warunków (tu dodania kwasu octowego i ogrzania) nastąpił proces koagulacji, a co za tym idzie rozwinięcie się łańcuchów polipeptydowych i zlepienie się ich w duże agregaty, a co za tym idzie w obu probówkach wytrącił się osad białka. W próbówce z jajem kurzym zaobserwowano obfitszy osad niż w probówce z albuminą.

Działanie etanolu:

Krótkotrwałe działanie etanolu powoduje wytrącenie się białka z roztworu, ale nie powoduje procesu denaturacji. Etanol wpływa na zmianę struktury przestrzennej cząsteczek białka. Osłabiają wiązania hydrofobowe i reagują bezpośrednio z naładowanymi grupami na powierzchni cząsteczki, naruszając tym samym „płaszcz wodny” cząsteczek białka.

W doświadczeniu użyto roztwór jaja kurzego i roztwór albiminy i dodano do niech etanolu. Wytrącił się biały osad. Osad w probówce gdzie była albumina rozpuszczał się.

Działanie stężonego HNO₃:

W doświadczeniu użyto roztwór jaja kurzego a w drugiej probówce roztwór albuminy a następnie dodano stężonego HNO₃ W miejscu zetknięcia się obu płynów w probówce, w której znajdowało się białko jaja kurzego powstał biały pierścień wytrąconego białka, natomiast w probówce z albuminą powstało zmętnienie.

---