Analiza jakościowa aminokwasów

20 aminokwasów stanowi budulec białek,

aminokwasy są także prekursorami w syntezie związków istotnych dla życia:

→

Glicyna – porfiryny (synteza, prekursor)

→

Glicyna, Glutamina, Kwas asparaginowy – puryny (synteza)

→

Glutamina, Kwas asparaginowy – pirymidyny (synteza)

→

Glicyna, Kwas glutaminowy, Kwas asparaginowy, GABA – neuroprzekaźniki

→

L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) – synteza dopaminy i adrenaliny

→

S-adenozylometionina – donor CH

3

w reakcjach metylacji

→

Ornityna i cyrulina – amin. cyklu mocznikowego

→

Ornityna – prekursor poliamin

→

Arginina – synteza tlenku azotu (substrat)

→

trijodotyronina, tyroksyna – hormony tarczycy (poch. tyrozyny)

Wszystkie aminokwasy białkowe są alfa (wyj. prolina), wszystkie steroizomery L (wyj. glicyna).

podział aminokwasów

→

hydrofobowe

•

Gly

•

Ala

•

Val

•

Leu

•

Ile

•

Met

•

Phe

•

Trp

•

Pro

→

hydrofilowe

•

Ser

•

Thr

•

Cys

•

Tyr

•

Asn

•

Gln

•

Asp ( kwaśne)

•

Glu ( kwaśne)

•

Lys (zasadowe)

•

Arg (zasadowe)

•

His (zasadowe)

Wykrywanie aminokwasów

Reakcja ninhydrynowa (ilościowe oznaczanie aminokwasów)

→

dekarboksylacja, deaminacja aminokwasów

→

powstaje: aldehyd uboższy o jeden węgiel, NH

3

i CO

2

→

ninhydryna redukuje się do hydrindantyny

→

purpura Ruhemana, związek niebiesko fiołkowy (ninhydryna, hydrindantyny, NH

3

)

→

prolina i hydroksyprolina dają żółte zabarwienie bo nie posiadają grupy α-aminowej

Reakcja ksantoproteinowa (wykrywanie aminokwasów aromatycznych)

→

aminokwasy aromatyczne po dolaniu stężonego kwasu i ogrzaniu, dają żółte pochodne
nitrowe

→

po zalkalizowaniu silniej zabarwione pochodne

Reakcja Adamkiewicza – Hopkinsa (wykrywanie układu indolowego)

→

w środowisku stężonych kwasów nieorganicznych związki zawierające układ indolowy
ulegają kondensacji z aldehydami tworząc barwne kompleksy:

•

z aldehydem mrówkowym (reakcja Voissenta)

•

z kwasem glioksalowym

Reakcja Pauli’ego (wykrywanie układy imidazolowego)

→

w środowisku alkalicznym

→

sprzęganie pierścienia imidazolowego histydyny z jonem p-sulfobenzenodiazoniowym

→

tworzą pomarańczowy barwnik azowy

Odczyn Sakaguchi’ego (wykrywanie układu guadyninowego)

→

w obecności utleniacza (bromian (I) sodu lub potasu)

→

grupa guanidynowa argininy tworzy z α naftolem pomarańczowoczerwony barwnik

→

mocznik stabilizuje powstały barwnik

Reakcja z nitroprustdkiem sodu (wykrywanie grup tiolowych)

→

nitroprusydek sodu i związki zawierające (-SH) tworzą kompleks o zabarwieniu czerwono
fiołkowym

Analiza jakościowa białek

funkcje białek:

→

substancje budulcowe

→

elementy kurczliwe

→

enzymy

→

hormony

→

cząsteczki transportujące

→

receptory komórkowe

→

czynniki wzrostu i różnicowania komórek

→

regulatory funkcji komórkowych

→

czynniki transkrypcyjne

→

substancje odpowiedzialne za odporność organizmu substancje zapasowe

→

toksyny

białko

→

jeden lub kilka łańcuchów polipeptydowych ( łańcuch zawiera 100 – 1000 aminokwasów)

→

masy cząsteczkowe są rożne( kilkanaście tysięcy do kilka milionów kDa)

•

lizozym – 14 kDa

•

albuminy – 68 kDa

•

konektyny (tityny) – ponad 3800 kDa

→

istnieją także białka złożone mające trwale wbudowanym składnik niebiałkowy (gliko-, liko-,
metalo-, chromoproteiny) :

•

cukrowy

•

lipidowy

•

jon metalu

•

naturalny barwnik

→

struktura

•

I rzędowa: sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym (podajemy od N-końca)

•

II rzędowa: rodzaj regularnego przestrzennego ułożenia łańcucha, stabilizowana
wiązaniami wodorowymi ( α-helisa, β-harmonikja )

•

III rzędowa: przestrzenne ułożenie całego łańcucha polipeptydowego stabilizowana przez
wzajemne oddziaływanie reszt bocznych ( oddziaływania : wodorowe, hydrofobowe,
elektrostatyczne, mostki disiarczkowe)

•

IV rzędowa: wzajemne położenia łańcuchów polipeptydowych ( tylko białka
oligomeryczne )

dimery (homodimery, heterodimery)

trimery

tetramery

Wykrywanie białek

Reakcja Biuretowa (wiązania peptydowe)

→

dają ją związki mające 2 wiązania peptydowe

→

biuret = dimocznik

→

w środowisku zasadowym wiązanie ulega tautomeryzacji (forma enolowa)

→

skompleksowanie jonów miedzi przez enolowe formy wiązań peptydowych

→

dwa wiązania jonowe z atomami tlenu

→

cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu

→

kompleks jest fioletowy

Wysalanie białek osocza

→

białka dobrze rozpuszczają się w wodzie i wodnych roztworach soli

→

duże stężenia soli powodują wysalanie białek ( konkurencja o cząsteczki wody)

→

jest to proces odwracalny

→

wysalanie przebiega najłatwiej w pH równym punktowi izoelektrycznemu

→

do wysalania stosuje się sole obojętne których jony tworzą hydraty np. (NH

4

)

2

SO

4

•

25% nasycenie – fibrynogen

•

50% nasycenie – globuliny

•

80% nasycenie – albuminy i dobrze rozpuszczalne globuliny

Denaturacja białek

→

Naruszenie lub zniszczenie natywnej konformacji białka, i utratę jego funkcji pod wpływem:

•

wysokiej temperatury

•

mocnych kwasów nieorganicznych

•

mocnych zasad

•

niektórych kwasów organicznych (trichlorooctowy, sulfosalicylowy, pikrynowy,
fosforowolframowy)

•

rozpuszczalników organicznych (alkohole, aceton)

•

kationów metali ciężkich ( Fe

2+

, Fe

3+

, Hg

2+

, Pb

2+

),

•

sole metali ciężkich stosuje się w preparatce białek

→

denaturowane białka są gorzej rozpuszczalne i często ulegają wytrąceniu z roztworu

→

do odbiałczania próbek osocza stosuje się kwas trichlorooctowy (TCA)

→

wytrącone białko usuwa się przez odwirowanie