Zasady projektowania starterów:

1. PCR podstawowy i z enzymami restrykcyjnymi

1. Długość 17-25

2. startery podobnej długości

3. G+C = 40-60%

4. na 3' końcu G lub C

5. T_a niższa o 2 - 5⁰ C od T_m

2. PCR ze zdegenerowanymi primerami

1. najniższy poziom zdegenerowania

2. primery dłuższe niż 17 nt

3. poziom zdegenerowania poniżej 64

4. Inozynę stosujemy w celu zmniejszenia poziomu zdegenerowania

5. liczymy T_m maksymalną i minimalną

3. RACE

1. G+C = 50 - 70%

2. T_a > 72⁰C

3. długość 23 - 28 nukleotydów

4. na 3' końcu tylko 2 G/C z 5 ostatnich nukleotydów

5. uważać na wzajemną komplementarność

4. Real - time PCR

1. tworzony amplikon o długości 75 - 200 pz

2. G+C = 50 - 60%

3. T_m w zakresie 50 - 60⁰C

4. unikać struktur drugorzędowych (uważać na komplementarność)

5. unikaj powtórzeń G/C dłuższych niż 3

6. G/C na końcach primerów

7. długość starterów 18 - 25 nt

5. Mutageneza ukierunkowana

1. oba startery muszą zawierać żądaną mutację i być do siebie komplementarne

2. długość 25 - 45 zasad

3. T_m > 78⁰C

4. Temperaturę się inaczej liczy!!

Zamiana zasad: Tm=81,5+0,41(%GC)-[675/N]-% zmienionych zasad

N - długość startera wyrażona w liczbach całkowitych, tak samo dla %GC

Insercja lub delecja: Tm=81,5+0,41(%GC)-[675/N]

N - nie zawiera zasad dodawanych lub usuwanych, %GC również nie zawiera nukleotydów dodawanych jak i odejmowanych. Obie wartości wyrażone są w liczbach całkowitych

5. 10 - 15 komplementarnych zasad po obu stronach mutacji

6. G+C powyżej 40%

7. startery dodatkowo oczyszczone

8. startery dodawane w nadmiarze

9. na obu końcach jedną lub kilka zasad G/C

6. Mutageneza przypadkowa

1. długość 18 - 25 nt

2. G+C = 40 - 60 %

3. oba końce zaczynają się od G/C

4. T_m w przedziale 55 - 72⁰C

5. G/C nie powinny występować w powyżej 3 powtórzeniach z rzędu

---