I. Pojęcie biotechnologii

-wykorzystanie techniki kultur in vitro

-zastosowanie metod genetyki molekularnej do diagnostyki i selekcji

-przenoszenie genów na drodze pozageneratywnej

a) Biotechnologia -definicja

b) Biotechnologia - zastosowanie wiedzy naukowej i inżynierii do przetwarzania organizmów , komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania dóbr i usług

1. Kultura in vitro

Kultura in vitro jest specyficznym sposobem uprawy materiału roślinnego w warunkach sterylnych, w różnego rodzaju pojemnikach.

Technika ta pozwala z małego fragmentu pobranego z organu rośliny uzyskać wzrost, rozmnożenie materiału i odtworzenie całej rośliny.

2. Technika in vitro znalazła zastosowanie do:

-otrzymywania form haploidalnych

-rozmnażania wegetatywnego cennych materiałów

-otrzymywania roślin wolnych od patogenów

- kultury zarodków

-kultury protoplastów (tworzenie mieszańców somatycznych)

-selekcji w kulturach in vitro

-produkcji metabolitów wtórnych, mikropropagacji i produkcji biomasy w bioreaktorach

-otrzymywania roślin transgenicznych

3. Niezbędnymi warunkami prowadzenia kultury in vitro jest dobór właściwego materiału roślinnego, pożywki do jej uprawy i warunków zewnętrznych - oświetlenia i temperatury.

4. Redyferencjacja

Bodźcem wyzwalającym odróżnicowanie w kulturach in vitro jest odizolowanie komórek i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce

II. Haploidy

1. Haploidy organizmy o gametycznej liczbie chromosomów

2. Monoploidy haploidy powstałe z organizmu diploidalnego

3. Polihaploidy haploidy powstałe z organizmu poliploidalnego

4. Rośliny haploidalne w kulturach in vitro można otrzymać poprzez:

- kultury pylników i mikrospor

- wykorzystując zjawisko eliminacji chromosomów w zarodkach mieszańców oddalonych

- wykorzystując geny stymulujące proces powstawania form haploidalnych

- metodami chemicznymi

5. Otrzymywanie haploidów w kulturach pylnikowych drogą androgenezy
a) Jest to proces złożony, zależny od wielu czynników:

- stanu fizjologicznego rośliny, z której pobierane są pylniki

- sposobu traktowania ściętych kłosów przed wyłożeniem pylników na pożywkę

- stadium rozwojowego pyłku

- komponentów pożywek indukcyjnych i regeneracyjnych

- warunków fizycznych hodowli pylników

b) Istnieją dwa zasadnicze kierunki rozwoju androgenicznego

- bezpośredni rozwój mikrospory w zarodek. W ciągu 4-8 tygodni z zarodków pojawiają się rośliny

• pośredni poprzez kalus

6. Wykorzystanie form haploidalnych

Wykorzystanie form haploidalnych i linii podwojonych haploidów w hodowli umożliwia skrócenie cyklu hodowlanego oraz zapewnia homozygotyczność form wyjściowych

Haploidy można wykorzystać w hodowli roślin jeśli:

- metodyka produkcji haploidów jest wydajna

- rośliny haploidalne powstają w sposób losowy (odpowiadają losowej segregacji gamet)

-znane są efektywne metody podwajania liczby chromosomów

III. Linie DH

Linie podwojonych haploidów (linie DH) są to formy powstałe w wyniku podwojenia liczby chromosomów u haploidów.

Podwajanie liczby chromosomów u haploidów przeprowadza się najczęściej przy użyciu kolchicyny.  

W-2

IV. Kultura zarodków

1. Kultury zarodków wykorzystuje się w celu:

- przerwania okresu spoczynku nasion

- Przyspieszenia okresu rozwoju roślin

- uzyskania roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania

- otrzymania roślin mieszańcowych

- otrzymania form haploidalnych

2. Przerwanie okresu spoczynku nasion

- Okres spoczynku nasion jest cechą indywidualną i charakterystyczną dla danego gatunku.

- W rodzaju Irys okres spoczynku wynosi do kilkudziesięciu miesięcy. Przerwanie okresu spoczynku nasion można uzyskać między innymi poprzez izolację zarodków z nasion na pożywki sztuczne.

3. Przyspieszenie okresu rozwojowego roślin

Wykorzystanie kultury in vitro do przyspieszenia okresu rozwojowego roślin coraz powszechniej wykorzystuje się w rodzaju Rosa. Poprzez kulturę in vitro zarodków przyspiesza się kwitnienie i skraca cykl rozwojowy

4. Uzyskiwanie roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania
Często w nasionach mieszańcowych bielmo ulega znacznym zaburzeniom w swoim rozwoju. Zarodek pozbawiony substancji odżywczych jakich dostarcza bielmo nie ma w warunkach naturalnych żadnych szans rozwoju. Przeniesienie takiego zarodka na pożywkę sztuczną zastępującą bielmo pozwala uzyskać wiele różnych mieszańców międzygatunkowych lub haploidów. W przypadku roślin ozdobnych metoda ta znajduje zastosowanie w hodowli róż.

5. Inne zastosowania

- Otrzymywanie form haploidalnych

- uzyskanie siewek z wielu drzew owocowych

- ocena żywotności nasion między innymi roślin ozdobnych, krzewów i drzew owocowych

6. Kultura zalążków z zarodkami

W praktyce często zamiast izolować zarodki, przenosi się całe zalążki zawierające zarodki we wczesnych stadiach embriogenezy. W przypadku roślin ozdobnych technika ta znalazła wykorzystanie w takich gatunkach jak Pisum, Helianthus, Glycine. Technika ta jest szczególnie przydatna w produkcji siewek storczyków, z uwagi na bardzo małe nasiona tego gatunku.

Przykłady : Petunia, Alstromeria, Lilium, Helianthus, Glycine, Gossypium

7. Zapylanie in vitro zalążni i zalążków

a) Niezgodność gatunkowa często uniemożliwia uzyskanie metodami klasycznymi interesujących hodowcę form

b) Bariery niekrzyżowalności można omijać poprzez zapylanie in vitro zalążni lub zarodków

c) Pozwala to na:

-ominięcie barier samoniezgodności i uzyskanie nowych rekombinantów roślin

-uzyskanie poprzez indukcję partenogenezy form haploidalnych

8. Przygotowamnie materiału: -Sposób postępowania:

- Zapobieżenie niekontrolowanemu zapyleniu

- Sterylizacja materiału (odpowiednich dla danego gatunku eksplantatów np. słupki, słupki z szypułką kwiatową i fragmentami okwiatu

- Przygotowanie pyłku do zapylenia

Larix, Picea, Pinus, Cayophyllaceae, Liliaceae ,Malvaceae, Primulaceae

9. Kultura niezapłodnionych zalążków

Jest to metoda alternatywna do techniki uzyskiwania haploidów drogą androgenezy. Wykorzystuje się tu zjawisko gynogenezy, czyli rozwoju zarodków z niezapłodnionych komórek gametofitu żeńskiego w warunkach kultury in vitro zarodków). U roślin ozdobnych stosunkowo łatwo jest uzyskać haploidy tą techniką u gerbery

10. Sztuczne nasiona

Produkt składający się z zarodka somatycznego lub zaczątku rośliny umieszczony w osłonce ochraniająco - odżywczej, zdolny do regeneracji roślin na skale komercyjną.

Najczęściej występują jako toczkowane odwodnione zarodki somatyczne lub uwodnione zarodki w otoczce hydrożelowej

W - 3

TEMAT: Uwalnianie roślin od wirusów - Metody eliminowania wirusów:

1. Kultura in vitro merystemów

- W obrębie rośliny zainfekowanej znajdują się komórki, grupy komórek a nieraz tkanki, w których nie można wykryć wirusa.

- Możliwość uwolnienia od wirusów roślin rozmnażanych wegetatywnie zapoczątkowało lawinowy rozwój kultury merystemów.

- Opracowano procedury izolacji odpowiednio małych wierzchołków pędu

a) Etapy odwirusowywania roślin drogą izolowanych merystemów

-. Odkażanie materiału roślinnego

-.Inkubacja w temp. 18-22 stopni C na świetle

-.Pasaże co 2-3 tygodni

-.Przesadzanie roślin do ziemi

-.Testowanie na zdrowotność

b) Rodzaje kultury merystemów stosowane w procedurze odwirusowywania

- Podział roślin na sadzonki węzłowe

Technika przydatna w masowej produkcji roślin ozdobnych i sadowniczych. Polega na pocięciu rośliny na fragmenty zawierające pęd z węzłem oraz znajdującymi się w węźle liśćmi oraz pąkami bocznymi. Uzyskane sadzonki węzłowe pasażuje się na kolejne pożywki.

Szeroko wykorzystywane w mikrorozmnażaniu Astromeria, Cymbidium, Gloriosa

- Kultura poliferujących zarodków

Poprzez dodanie do pożywki cytokinin w dużym stężeniu uzyskuje się tzw. wieloroślinki. Ponowne podziały i pasaże pozwalają na uzyskanie tysięcy roślin potomnych.

Szeroko stosowana do rozmnażania Dianthus, Chrysanthemum, Rosa multiflora i wielu innych.

- Za pośrednictwem kalusa

- Wirusy uporczywe

Istnieją wirusy tzw. uporczywe, do których zwalczania konieczne jest zastosowanie w kulturach in vitro dodatkowo innych procedur.

2. Chemoterapia

Chemoterapia polega na dodaniu do pożywki tzw. antymetabolitów, czyli substancji o wysokiej aktywności przeciwwirusowej. Są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich rozmnażanie się.

3. Termoterapia

Pod wpływem długotrwałego działania podwyższoną temperaturą ( w granicach 26-45 stopni C. w czasie od 1-3 miesięcy) następuje inaktywacja wirusów w tkankach rośliny. Terapii cieplnej poddaje się całe rośliny lub ich organy wegetatywne. Po zakończeniu procesu termoterapii, z roślin tych pobiera się tkanki merystematyczne i dalej prowadzi kulturę in vitro w celu uzyskania roślin. Metoda ta znalazła zastosowanie między innymi do odwirusowywania chryzantem i goździków.

4. Krioterapia

Krioterapia - działanie niskimi temperaturami (0d +1-4 stopni)

W-4

TEMAT: Mikrorozmnażanie roślin na skalę wielkotowarową

1. Kwalifikowany materiał rozmnożeniowy

- Uzyskany na drodze mikrorozmnażania materiał musi być wolny od patogenów.

- Producent powinien wydać certyfikat międzynarodowy (ISO-9001 lub HACCP) gwarantujący jakość produktu jak i zachowania odpowiednich procedur w procesie produkcji

2. Materiał rozmnożeniowy musi spełniać jakościowe normy genotypu

- OWT (oryginalność, wyrównanie, trwałość)

- Prawidłowa kondycja roślin

- Adaptacyjność rozwojowa

3. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne eksplantatów

a) Patogeny (bakterie, mikoplazmy, grzyby)

b) Epifity zasiedlające powierzchnię organów:

-mikoplazmy (charakteryzują się brakiem ściany komórkowej)

-bakterie

-grzyby

4. Bakterie epifityczne

- Bakterie gramujemne na ogół stymulują mechanizmy odpornościowe roślin na niesprzyjające warunki środowiska, oraz mechanizmy obronne na patogeny grzybowe i bakterie

- Występują zarówno pojedynczo jak i w grupach często w trudno dostępnych miejscach (pod łuskami przylistkami, w pąkach itp..). Trudne do dezynfekcji.

5. Endofity

- Endofity- grzyby i bakterie przeżywające większą część życia wewnątrz organizmów. Często uważa się, że żyją w symbiozie z rośliną.

- Przykłady: bakterie tzw. brodawkowe (Acetobacter)

- Bakterie wydzielające toksyczne dla owadów i nicieni metabolity (lolitrem B i ergowalinę). Ochraniają rośliny przed tymi organizmami

6. Zapobieganie infekcji materiału w stadium początkowym kultury in vitro

- Pojawiające się w początkowym okresie kultury in vitro drobnoustroje na eksplantatach lub pożywce są wnoszone z eksplantatami

- Zapobieganie : specjalne traktowanie roślin w fazie prekultury (poprzedzającej pobieranie eksplantatów), tzw. stadium „0”

7. „Punkty kontrolne” i etapy pracy w procesie mikrorozmnażania wielkotowarowego

a) Prekultury

Prekultura - zespół zabiegów pozwalających otrzymać odmłodzone eksplantaty , częściowo lub całkowicie wolne od patogenów.

Selekcja wartościowych okazów, które będą podlegały klonowaniu

- Zabezpieczenie roślin przed infekcją (opryski, sposób podlewania

- Zidentyfikowanie bakterii i grzybów Test ELISA, PCR i inne)

- Przygotowanie rośliny , części roślin lub eksplantatów do kultury in vitro, termoterapia

- Dezynfekcja powierzchniowa

- Dezynfekcja wewnętrzna (np. zieleń malachitowa)

- Stosowanie fungicydów i pestycydów

b) Stabilizacja eksplantatów

- Cel: uzyskanie zdrowych eksplantatów poprzez zapobieganie infekcją.

Na tym etapie prac szczególną uwagę zwraca się na:

*umiejętną sterylizację

*sprawny sprzęt (kontrola sterylności pomieszczeń, stołów laminarnych)

*eliminację eksplantatów zaatakowanych patogenami

*indeksację roślin matecznych

---