Techniki inżynierii genetycznej
Heterozja jest to zjawisko zwiększonej żywotności i wybujałości roślin i zwierząt będącymi potomkami mieszańców. Formy mieszańcowe powstają z form homozygotycznych. Formy homozygotyczne uzyskuje się poprzez wielokrotne samozapylenie ( u roślin ) lub długotrwałe krzyżowanie w pokrewieństwie.
Niektóre rośliny, w określonych warunkach wykazują tendencję do samozapylenia. Z nasion powstałych poprzez samozapylenie wyrastają rośliny słabo wykształcone i mało żywotne. Kolejne pokolenia roślin powstałych w wyniku samozapylenia charakteryzują się jeszcze niższą żywotnością. Zjawisko to określane jest jako depresja inbredowa ( chowu wsobnego ).
Chów wsobny, czyli krzyżowanie w pokrewieństwie jest przyczyną zwiększania się homozygotyczności w następnych pokoleniach. Chów wsobny powoduje obniżenie żywotności organizmów potomnych a także ujawnienie się genów letalnych a tym samym eliminację osobników je posiadających. Dzięki prowadzeniu hodowli wsobnej ( np. kukurydzy, żyta ) uzyskuje się tzw. linie wsobne, które wykorzystuje się w hodowlach heterozyjnych. Hodowla heterozyjna prowadzi do zwiększenia ilości cech dominujących u mieszańców. U form mieszańcowych dochodzi do różnych kombinacji i współdziałania genów. Wynika z tego, że wykształcenie się określonej cechy nie jest efektem działania jednego genu, lecz współpracy kilku genów. Heterozja cechuje się nietrwałością, tzn. że efekt heterozji jest najbardziej widoczny w pokoleniu pierwszym mieszańców ( F1 ), w kolejnych pokoleniach efekt ten maleje ( w przypadku samozapylenia ). Efekt heterozji obserwuje się w polepszeniu się cech użytkowych rośliny ( np. szybszy wzrost, powiększenie nasion ) a także cech fizjologicznych.
Poliploidalność.
Jest to zjawisko zwiększenia genomu ( kompletu chromosomów ) w komórkach żywych organizmów. Organizmy zbudowane z komórek o poliploidalnych jądrach zwane są poliploidami. Obecnie często prowadzone są liczne próby uzyskania poliploidalnych roślin ze względu na ich duże znaczenie w rolnictwie. Rośliny poliploidalne charakteryzują się szybszym wzrostem, większymi rozmiarami i wartościami odżywczymi.
Powszechnie stosowanym środkiem do wywoływania poliploidalności u roślin jest kolchicyna - substancja uzyskiwana z zimowita wiosennego. Kolchicyna powoduje zaburzenia tworzenia się wrzeciona podziałowego. Potraktowana kolchicyną komórka zwiększa swoje rozmiary, namnaża materiał genetyczny ale nie ulega podziałom. Podawanie dużej ilości kolchicyny powoduje niebezpieczne zwiększanie się poliploidalności , w związku z tym proces ten należy zatrzymać. Inna substancją wywołującą zwielokrotnienie genomu jest acenaften.
Niekiedy do zwiększenia ploidalności komórek stosuje się także niskie temperatury. Obniżenie temperatury powoduje wstrzymanie procesów mitozy, czego efektem może być powstanie gamet o niezredukowanym genomie, czyli gamet diploidalnych ( 2n ). W wyniku połączenia się takich gamet powstaje tetraploid ( 4n ).
W praktyce laboratoryjnej stosuje się kilka metod wybierania roślin poliploidalnych. Często oddziela się organizmy poliploidalne od diploidalnych. Znaną metoda jest również barwienie chromosomów i liczenie ich pod mikroskopem, co pozwala na określenie ploidalności danego organizmu. Organizmy poliploidalne z reguły są większych rozmiarów, niż przedstawiciele tego samego gatunku o niezmienionej ploidalności. Czasem zdarza się, że wzrost poszczególnych organów rośliny nie jest jednakowy; obserwuje się wtedy tzw. gigantyzm organów. Poliploidy wykazują także większość odporność na wysychanie, ponieważ posiadają mniejszą liczbę szparek na powierzchni liści, co zabezpiecza te rośliny przed intensywnym parowaniem. Kolejnym, korzystnym efektem poliploidyzacji jest zwiększenie rozmiarów owoców roślin o zwielokrotnionym genomie. Zjawisko to ma szczególne znaczenie w sadownictwie. Najlepszą jakością charakteryzują się owoce tetraploidalne ( 4n ). Zbyt duża ploidalności rośliny powoduje nieprawidłowe wykształcanie się jej organów. Badania dotyczące poliploidalności buraków pastewnych i cukrowych wykazały , że najkorzystniejsze cechy posiadają rośliny triploidalne ( 3n ).
Nieustanne badania genetyczne prowadzą do powstania nowych technik mających na celu uzyskanie organizmów o wyższej wydajności i żywotności. Obecnie stosuje się również metodę hodowli całego organizmu z jednej komórki pozyskanej ze specjalnej hodowli laboratoryjnej. W hodowli roślin wykorzystywana jest także metoda klonowania, która stanowi pewien rodzaj rozmnażania wegetatywnego. Klonowanie polega na wytworzeniu nowego organizmu z komórek jednego organizmu rodzicielskiego. Proces ten polega na pobraniu komórek somatycznych i płciowych z jednego organizmu, po czym jądro z komórki płciowej ( jajowej ) przenosi się do komórki somatycznej ( pozbawionej uprzednio jądra ). Tak zmodyfikowaną komórkę pobudza się ( poprzez impulsy elektryczne ) do podziałów, które prowadzą do powstania nowego organizmu. Organizmy powstałe w wyniku klonowania ( klony ) posiadają genom identyczny z genomem organizmu rodzicielskiego.
Istnieje wiele technik inżynierii genetycznej , które mają na celu polepszenie właściwości organizmów żywych. Jedną z metod jest wprowadzanie do genomu jednego organizmu dodatkowych genów o znanej ekspresji. Organizm wzbogacony o dany gen posiada nowe właściwości , jakich nie mają inni, niezmienieni genetycznie przedstawiciele tego samego gatunku. Przykładem takiego działania jest wprowadzenie genu odpowiedzialnego za syntezę insuliny do genomu bakterii Escherichia coli. Bakterie o zmienionym genomie mają zdolność syntezy insuliny - hormonu potrzebnego w leczeniu cukrzycy.
Obecnie prowadzi się doświadczenia dotyczące wprowadzenia do genomu roślin genu odpowiedzialnego za produkcję specyficznych białek uczestniczących w procesie wiązania azotu z atmosfery. Badania te skupione są głównie na roślinach zbożowych, które mogłyby dzięki temu wchodzić w symbiozę z bakteriami posiadającymi zdolność wiązania azotu. Zmodyfikowane w ten sposób rośliny miałyby istotne znaczenie w wielu gałęziach przemysłu, a przede wszystkim w rolnictwie.
Inżynieria genetyczna.
Techniki stosowane w inżynierii genetycznej mają na celu określenie ekspresji poszczególnych genów w organizmie macierzystym jak również w obcym organizmie. Aby zrozumieć zabiegi stosowane w inżynierii genetycznej należy posiąść wiedzę z zakresu genetyki bakterii, enzymów replikacyjnych, budowy plazmidów i działania wektorów.
Wektory.
Wektorami stosowanymi technikach genetycznych są wirusy i plazmidy.
Wirusy są specyficznymi organizmami, które posiadają cechy pośrednie dla organizmów żywych i materii nieożywionej. Ciało wirusa stanowi rdzeń zbudowany z materiału genetycznego ( RNA lub DNA ) oraz otaczająca go otoczka białkowa, zwana kapsydem.
Wirusy wykazują funkcje życiowe jedynie po przedostaniu się do komórki gospodarza. Wirus włącza swój materiał genetyczny do materiału genetycznego gospodarza, dzięki czemu może się namnażać. Materiał genetyczny wbudowany w genom gospodarza namnaża się dzięki replikacji genomu komórkowego. Wniknięcie wirusa do komórki ( infekcja ) bardzo często powoduje zmiany w jej prawidłowym funkcjonowaniu.
Zdolność wirusów do wbudowywania swojego genomu do genomu komórek gospodarza wykorzystane zostało w inżynierii genetycznej.
Wirusy często wykazują specyficzność w stosunku do komórek jakie infekują. Na przykład wirusy brodawek, ospy, odry infekują jedynie komórki skóry, natomiast wirusy wścieklizny atakują rdzeń kręgowy i mózg.
W celu zwalczania wirusów stosuje się szczepionki. Szczepionki są zawiesinami nieaktywnych cząsteczek wirusa , które wstrzykuje się do krwi człowieka. W wyniku przedostania się tych cząsteczek do krwi, układ immunologiczny człowieka wytwarza odpowiednie przeciwciała przeciw temu wirusowi. Dzięki temu w krwi człowieka krążą przeciwciała gotowe do zniszczenia wirusa - organizm nabiera odporności.
Bakteriofagi są podgrupą wirusów, które atakują komórki bakteryjne określonego szczepu. Jak dotąd nie udało się wykorzystać bakteriofagów w leczeniu chorób bakteryjnych.
Ciało bakteriofaga stanowi główka i ogonek. W główce znajduje się materiał genetyczny faga, który osłonięty jest otoczką białkową. Infekcja komórki bakteryjnej przez bakteriofaga rozpoczyna się rozpuszczeniem jej ściany komórkowej enzymem zawartym w ogonku faga. Następnie kwas nukleinowy zostaje wstrzyknięty do komórki bakteryjnej. Na zewnątrz tej komórki pozostaje otoczka białkowa ogonka i główki. Materiał genetyczny faga łączy się z genomem gospodarza. W komórce następuje synteza białek wirusowych.
Plazmidy.
Plazmidy są niewielkimi kolistymi cząsteczkami DNA występujące w komórkach bakteryjnych . W komórkach bakterii występują poza tym typowe chromosomy bakteryjne.
Plazmidy mogą replikować się niezależnie od genomu bakteryjnego. Można je łatwo pobrać z komórki.
Plazmidy, fagi, wirusy są typowymi wektorami wykorzystywanymi w różnych technikach inżynierii genetycznej. Wektory są pewnego rodzaju nośnikami genów , które wprowadza się do obcego genomu.
Obecnie stosowane wektory używa się powszechnie do wprowadzania genów do komórek prokariotycznych ( bakteryjnych ). Z kolei niewiele jest znanych skutecznych wektorów używanych do transferu genów do komórek eukariotycznych.
Wprowadzanie obcych genów do określonych wektorów.
Za włączenie genu do genomu wektorowego odpowiedzialne są enzymy z rodziny restryktaz. Restryktazy odpowiedzialne są za nacięcie DNA przeznaczonego do transferu w ściśle określonym miejscu. Enzymy te nacinają DNA wektorowe, w miejscu w którym będzie wbudowany będzie obcy gen oraz warunkują połączenie się tego genu z DNA wektorowym.
Techniki inżynierii genetycznej.
Wprowadzenie badanego genu do plazmidu.
W plazmidzie występuje specyficzna sekwencja DNA , którą restryktaza rozpoznaje i nacina. Natomiast w badanym DNA jest określony gen , które koduje interesujące nas białko.
DNA badane i DNA plazmidowe jest traktowane restryktazą, czego efektem jest nacięcie DNA plazmidowego oraz nacięcie DNA badanego na liczne odcinki. Jeden z tych odcinków prawdopodobnie zawiera poszukiwany gen.
Przecięcie DNA przez restryktazę powoduje powstanie odcinków z tzw. lepkimi końcami. Tak pocięte odcinki DNA badanego miesza się z odcinkami DNA plazmidowego. W mieszaninie tej dochodzi do samorzutnego łączenia się odcinków DNA za pośrednictwem „lepkich końców”. Efektem tego łączenia jest powstanie nowej kolistej cząsteczki plazmidu wzbogaconej o obce odcinki DNA. Tak zrekonstruowany plazmid wprowadza się do komórek bakteryjnych. Wśród komórek- biorców zmienionego plazmidu istnieją komórki zawierające szukany przez nas gen. Ta metoda określana jest jako „ strzelanie na ślepo”, ponieważ otrzymanie komórek zawierających badany gen jest wynikiem przypadku.
Wyizolowanie odcinka DNA genu X.
Odcinek mRNA odpowiedzialny za syntezę białka X miesza się z DNA poddanym uprzednio procesowi denaturacji. Następuje łączenie się na zasadzie komplementarności mRNA z odpowiednim odcinkiem DNA. Pozostałe odcinki DNA ( nie złączone z mRNA ) ulegają rozkładowi pod wpływem działania enzymu - nukleazy S. Pozostały odcinek DNA odszczepia się od mRNA przy użyciu specyficznego enzymu. Odcinek ten następnie podaje się procesowi replikacji. Po zreplikowaniu, do cząsteczek DNA dołącza się odcinki poliadeninowe ( z użyciem specjalnych enzymów ). Z pociętych przez restryktazę odcinków DNA plazmidowego usuwa się „lepkie końce”. Odcinki DNA plazmidowego i DNA genu X miesza się.
Dzięki metodom inżynierii genetycznej można wycinać DNA z jednego organizmu i przenieść go do drugiego za pośrednictwem wektora. Inżynieria genetyczna ma na celu wykorzystanie w jednym organizmie genów pobranych z drugiego organizmu.
Popularną metoda stosowaną w tym celu jest „ strzelanie na ślepo”. Metoda ta polega na izolowaniu interesującego nas DNA i przecięciu go na kilka odcinków przez enzym restryktazę. Ten sam enzym używany jest do cięcia DNA plazmidowego , stosowanego jako wektor. Plazmid jest tak dobrany, by nacięcie przez restryktazę obejmowało miejsce, w którym znajduje się gen kodujący odporność bakterii na antybiotyk. Rozcięty DNA plazmidowy, który w formie naturalnej jest kolisty, staje się otwartym łańcuchem DNA. W wyniku działania restryktazy na DNA powstają, w miejscu przecięcia, tzw. lepkie końce. Lepkie końce łączą się ze sobą na zasadzie komplementarności. Dna plazmidowe miesza się z pociętym DNA zwierzęcym ,zawierającym interesujący nas gen. W wyniku mieszania się DNA plazmidowego i DNA zwierzęcego następuje odtworzenie się prawidłowych kolistych cząsteczek plazmidu oraz kolistych cząsteczek plazmidu wzbogaconych o odcinki DNA zwierzęcego. Łączenie się odcinków zwierzęcego DNA z cząsteczkami plazmidu jest zupełnie przypadkowe.
Odbudowany na nowo plazmid wprowadza się do komórek bakteryjnych. Rozpoznanie, czy dany plazmid jest plazmidem pierwotnym czy zrekombinowanym polega na przeprowadzeniu testu na odporność komórek bakteryjnych, będących biorcami cząsteczek plazmidu.
Plazmid wykorzystywany jako wektor posiada dwa geny odporności na antybiotyki : gen a i gen b. W czasie cięcia DNA plazmidowego przez restryktazę dochodzi do uszkodzenia jednego genu odporności. Odcinek DNA kodujący odporność na jedne antybiotyk jest hipotetycznym miejscem przyłączeni się cząsteczki zwierzęcego DNA. A zatem, komórki bakteryjne, które przyjęły zrekombinowanym plazmid wykazują odporność tylko na jeden z dwóch antybiotyków. Natomiast komórki, które pobrały plazmid pierwotny są odporne na obydwa antybiotyki. Jeżeli pewne bakterie wykazują wrażliwość na jedne antybiotyk, to świadczy to o tym ,że zawierają one plazmid zreplikowany. Zakłada się, że w puli komórek bakteryjnych zawierających zrekombinowanym plazmid występuje odcinek DNA kodujący interesujące nas białko. Komórką zawierającą dany gen jest ta, która syntetyzuje białko przez ten gen kodowane. Ważne jest aby sprawdzić, czy gen pobrany od obcego organizmu ulega ekspresji w komórce bakteryjnej. W tym celu stosuje się przekształcanie odcinków DNA, które leżą w bliskim sąsiedztwie badanego genu. Do genu tego przyłącza się operator lub promotor pochodzący z DNA bakteryjnego. Jeżeli następuje prawidłowa ekspresja tak zmienionego genu, to oznacza , że interesujący nas gen ulega ekspresji w komórce bakteryjnej.
Innym sposobem sprawdzenia obecności badanego genu w plazmidzie jest pobudzenie komórki bakteryjnej do zwiększonej produkcji białka , które jest produktem tego genu. W tym celu indukuje się intensywną replikację plazmidu bakteryjnego. Jeżeli plazmid zawiera badany gen, to ilość kopii plazmidu będzie równa ilości kopii tego genu.
Następnym etapem jest wyizolowanie białka kodowanego przez dany gen a następnie określenie właściwości tego białka i jego aktywności biologicznej.
Wyizolowany odcinek mRNA badanego przez nas genu można zidentyfikować inną metodą. Metoda ta wykorzystuje enzym, który występuje w cząsteczkach retrowirusów. Enzym ten - odwrotna transkryptaza ma zdolność namnażania DNA na matrycy mRNA. Dzięki temu enzymowi możliwe jest odtworzenie pojedynczej nici DNA na podstawie mRNA badanego genu. Uzyskany odcinek DNA będzie szukanym przez nas genem.
Do badań genetycznych niezbędna jest wiedza dotycząca budowy DNA oraz kodu genetycznego. Gen jest odcinkiem DNA o specyficznej kolejności nukleotydów. Budowę genu ( kolejność nukleotydów tworzących gen ) można odkryć na podstawie sekwencji aminokwasów budujących dane białko.
Postęp w dziedzinie genetyki i rozwój inżynierii genetycznej pozwolił na to, że obecnie możliwe jest otrzymanie niektórych białek ( np. inuliny, neurohormonów ) bez obecności organizmów żywych.
Dzięki licznym technikom inżynierii genetycznej możliwe jest zmienianie genomu , a zarazem właściwości wielu szczepów bakterii, efektem czego jest powstawanie nowych szczepów. Nowe szczepy często posiadają właściwości, których nie mają inne gatunki. Najczęstszym celem badań jest wprowadzenie do genomu bakteryjnego genu zwierzęcego, który koduje ważne ( z medycznego punktu widzenia ) białko. Produkcja białek przez bakterie ( np. insuliny przez bakterie E.coli ) jest dużo wydajniejsza i tańsza , niż izolacja tych białek z materiału zwierzęcego.
Ze względu na trudności w wprowadzaniu genów do genomu eukariotycznego , badania nad transferem genów skupione są głównie na komórkach bakteryjnych. Jednak znane są już pewne osiągnięcia w przenoszeniu genów do komórek organizmów żywych.
Obecnie hoduje się tkanki i komórki zwierzęce, które wykorzystywane są w transferze genów. Przenoszenie genów odbywa się w obrębie gamet lub zygot.
Przenoszenie genów w obrębie komórek roślinnych jest utrudnione ze względu na obecność ściany celulozowej.
Inżynieria komórkowa.
Inżynieria ta obejmuje zabiegi dotyczące jąder komórkowych a nawet całych komórek.
Dzięki inżynierii komórkowej uzyskiwane są przeciwciała monoklinalne. Metoda ta polega na łączeniu komórek pochodzących od różnych gatunków zwierząt. Metoda ta jest skuteczna i wydajna ponieważ powstałe komórki mieszańcowe wytwarzają tylko jeden rodzaj przeciwciał. Natomiast w przypadku pozyskiwania przeciwciał z krwi uodpornionego zwierzęcia otrzymuje się mieszaninę różnorodnych przeciwciał.
Klonowanie.
Jest to technika otrzymywania organizmów identycznych pod względem genetycznym.
Do wytworzenia klonu pobierane są komórki tylko z jednego organizmu macierzystego. Powstanie klonu nie poprzedza zjawisko zapłodnienia komórki jajowej przez komórkę plemnikową. Z komórki jajowej pobranej z organizmu macierzystego usuwa się jądro i zastępuje się je jądrem pobranym z komórki somatycznej tego samego organizmu. Zmodyfikowaną komórkę aktywuje się do podziałów komórkowych i hoduje się w laboratorium. Kilkunastokomórkowy zarodek wprowadza się do macicy matki zastępczej. Po okresie ciąży rodzi się klon.
Pierwszym sklonowanym ssakiem jest owca Dolly. Dokonali tego angielscy naukowcy w 1996 roku. Było to przełomowe wydarzenie w dziedzinie nauk biologicznych. Klonowanie daje duże możliwości w leczeniu wielu chorób. Wytwarzanie organów drogą klonowania byłoby wielką szansą dla osób czekających na przeszczepy. Obecnie prowadzone są liczne badania dotyczące komórek macierzystych.
Zgodnie z regulaminem serwisu www.bryk.pl prawa autorskie do niniejszego materiału posiada Wydawnictwo GREG. W związku z tym, rozpowszechnianie niniejszego materiału w wersji oryginalnej albo w postaci opracowania, utrwalanie lub kopiowanie materiału w celu rozpowszechnienia w szczególności zamieszczanie na innym serwerze, przekazywanie drogą elektroniczną i wykorzystywanie materiału w inny sposób niż dla celów własnej edukacji bez zgody Wydawnictwa GREG podlega grzywnie, karze ograniczenia wolności lub pozbawienia wolności.