ENZYMOLOGIA - EGZAMIN

Enzymy:

• ułatwiają tworzenie stanu przejściowego reakcji;

• obniżają energię aktywacji, zapewniają nowy przebieg reakcji, w którym stan przejściowy ma mniejszą energię swobodną;

• nie wpływają na spontaniczność reakcji i jej równowagę.

Miejsce aktywne (centrum aktywne) - obszar (trójwymiarowa szczelina, unikalne mikrośrodowisko) wiążący pasujące substraty (i kofaktor^?). Zawiera reszty AA, biorące bezpośredni udział w tworzeniu i rozrywaniu wiązań za pomocą wielu słabych oddziaływań, a co za tym idzie tworzenie stanu przejściowego.

Koenzym - rodzaj kofaktora. Niskocząsteczkowe związki organiczne (np. witaminy i ich pochodne), biorące udział w reakcji enzymatycznej poprzez oddawanie lub przyłączanie pewnych reagentów, nietrwale łącząc się z enzymem.

Izomerazy - należą do nich: racemazy i epimerazy (np. modyfikacja L- do D-alaniny), izomerazy cis-trans, wewnątrzcząsteczkowe (np. modyfikacja aldoz do ketoz i odwrotnie).

Transferazy - należą do nich: transferazy przenoszące grupy jednowęglowe, grupy aldehydowe i ketonowe, grupy alkilowe lub pośrednie, grupy zawierające azot lub fosfor, acylotransferazy, glikozylotransferazy. Przykładem może być kinaza NAD (przeniesienie fosforanu z ATP na NAD z wytworzeniem ADP i NADP).

Rodzaje wiązań między enzymem a substratem w CA - oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe.

Stan przejściowy reakcji chemicznej - stan o najwyższej energii swobodnej po zderzeniu dwóch lub trzech cząsteczek substratów. Wytwarza się wtedy hipotetyczny kompleks aktywny. Najrzadziej występujący stan związków reagujących w czasie reakcji. Opisany schematem S → X → P.

Energia aktywacji reakcji - różnica energii swobodnej między stanem przejściowym a substratem.

Inhibitory reakcji enzymatycznych - inhibitory właściwe i niewłaściwe (pH, siła jonowa, tempratura, stężenie soli).

Inhibicja niekompetycyjna - zmniejsza V_max, ponieważ obniża stężenie funkcjonalnego enzymu (następuje pozorne rozcieńczenie roztworu enzymu). Inhibitor nie konkuruje z substratem o centrum aktywne, a jedynie częściowo je blokuje, zmniejszając jego zdolności katalityczne.

Inhibicja zwrotna (allosteryczna) - połączenie się związku (niepodobnego do substratu) z enzymem poza CA, wywołujące zmianę konformacji enzymu (III- lub IV-rzędowej struktury) i zniekształcenie CA. Przykładem jest hamowanie heksokinazy przez glukozo-6-fosforan, wywołujące mniejsze wykorzystanie glukozy.

Inhibitor ciasno wiążący (tight-binding) - wiąże się z enzymem z tak wysokim powinowactwem, że wiązanie inhibitora przez enzym w istotny sposób zmienia stężenie wolnego inhibitora. Taki inhibitor oddziałuje z enzymem w stosunku niemal stechiometrycznym. Aby rozpoznać inhibitor ciasno wiążący, należy zastosować bardzo wysokie stężenie substratu (inaczej wykres 1/V do 1/[S] jest podobny do wykresu dla klasycznej inhibicji niekompetycyjnej).

Inhibitor wolno wiążący - hamowanie takim inhibitorem nie przebiega liniowo, a krzywoliniowo. Niezbędne są zmiany konformacyjne przed utworzeniem kompleksu z enzymem. W czasie preinkubacji enzymu z inhibitorem ustala się stan równowagi, zaburzany przez dodanie substratu. Z powodu powolnego wiązania krzywe powstawania produktu początkowo są nisko nachylone, potem osiągająszybkość stanu ustalonego.

IC₅₀ - stężenie inhibitora niezbędne do osiągnięcia połowy całkowitej inhibicji. Pomiar IC₅₀ dla inhibicji kompetycyjnej wymaga jednakowych stężeń substratu w każdej próbie.

Model indukowanego dopasowania (induced fit model) - najdoskonalszy model sformułowany przez Koshlanda. Centrum aktywne podlega rearanżacjom przestrzennym w wyniku oddziaływań substratu, a grupy AA ściśle dopasowują się do wiązanej cząsteczki. Dopiero potem możliwa jest kataliza. Nierzadko cząsteczki substratu również ulegają rearanżacjom po wejściu do centrum aktywnego, wzmacniając dopasowanie.

Wpływ struktur rezonansowych na katalizę - podwójny charakter wiązania C=N organicza możliwość rotacji wzdłuż osi C-N, a 6 atomów AA leży w jednej płaszczyźnie. Umożliwia to tworzenie ciasno upakowanych struktur globularnych i ogranicza ilość możliwych stereoizomerów łańcucha polipeptydowego do cis i trans. ?

Międzynarodowa jednostka aktywności - 1U = taka ilość enzymu, która katalizuje wytworzenie 1 μmola produktu w ciągu 1 minuty w określonych warunkach.

Aktywność całkowita - aktywność enzymu w stosunku do masy próbki.

Aktywność specyficzna - aktywność enzymu odniesiona do masy enzymu (białka) w preparacie. Np. μmol_{wytw. prod.} · min^-1 · mg_białka^-1. ?

Liczba obrotów (aktywność cząsteczkowa) - ilość moli substratu przemienionego w ciągu minuty przez 1 mol enzymu.

Jakie próby kontrolne wykonujemy do prawidłowego oznaczenia enzymu - potrzebujemy dwóch kontrolnych pomiarów bez enzymu i bez substratu, co pozwala na dokładne określenie absorbancji lub fluorescencji w czasie 0. Wyniki prób kontrolnych należy odjąć od odczytów w każdym punkcie czasu.

Pomiar aktywności - W przypadku reakcji sprzężonych badana reakcja musi być ograniczająca. Przy pomiarze wpływu inhibitora na enzym obecność innego enzymu utrudnia badanie - nie wiemy, który z enzymów jest hamowany. Czas trwania fazy liniowej reakcji enzymatycznej trzeba wyznaczyć eksperymentalnie, dopiero potem możemy dokonywać pomiaru w odstępach czasowych w fazie liniowej.

Mieszaninę do pomiaru należy odpowiednio wymieszać, a w czasie 0 dodać ostatni składnik (enzym albo substrat w zależności od specyfiki reakcji, ale w takiej ilości, by nie stanowił więcej niż 5-10% objętości całej mieszaniny) i energicznie wymieszać, by mieszanie nie zachodziło w czasie pomiaru.

Reakcję zatrzymujemy przez gwałtowne zamrożenie (suchy lód + etanol), denaturację lub dodanie związku interferującego z danym enzymem (np. związek chelatujący metale, EDTA).

Aktywność enzymu regulują:

• inhibitory i aktywatory,

• oddziaływania allosteryczne,

• wiązanie białek stymulujących i hamujących,

• odwracalne modyfikacje kowalencyjne (np. fosforylacja),

• aktywacja proteolityczna (proenzymy),

• regulacja syntezy i rozkładu enzymu.

Wybór dobrego substratu dla enzymu - dobry substrat cechuje wysoka k = V_max / K_m (stała szybkości).

Wpływ protonów na aktywność enzymu - protony mogą przyczynić się do zmiany pH, ich obecność warunkuje także zachodzenie katalizy kwasowo-zasadowej.

Wykres Arrheniusa - wykres przedstawiający zależność log(V_max) lub log(k_cat) od 1 / 2,3RT. Pozwala na określenie energii aktywacji (E_a - oznaczona jako krzywa). Wyznaczany na podstawie analizy aktywności enzymów w przedziale temperatur, w których nie zachodzi denaturacja białka.

Stała Michaelisa K_m - wyznaczona eksperymentalnie wielkość, określająca takie stężenie substratu, przy którym V stanowi połowę V_max. K_m = (k_-1 + k₊₂) / k₊₁, czyli stosunek sumy stałych szybkości rozpadu ES do E+S i E+P. W przypadku niektórych reakcji k_-1 jest znacznie większe od k₊₂ i w tym przypadku K_m = k_-1 / k₊₁. Inaczej K_m przedstawiamy jako V = V_max / 2. Zazwyczaj podawana w mol / dm³.

Zastosowanie K_m pozwala nam na (wymagane 3 zastosowania): matematyczny opis kinetyki i ilościowy pomiar aktywności enzymu, określenie mechanizmów regulujących, oszacowanie stężenia substratu w komórce, porównanie enzymów z różnych źródeł (tkanek/organizmów/etapów rozwoju), określenie, czy ligand reguluje aktywność enzymu, opracowanie warunków do pomiaru V_max, porównanie powinowactwa enzymu do różnych substratów, wybór najlepszego substratu dla enzymu (po największym stosunku stałej szybkości reakcji - V_max/K_m = k).

Dlaczego K_m rośnie w przypadku inhibicji kompetycyjnej - inhibitor kompetycyjny redukuje stężenie aktywnych cząsteczek enzymu, maleje więc proporcja cząsteczek enzymu wiążących substrat. Niezbędne jest zastosowanie większego [S], aby wyprzeć inhibitor z CA enzymu. Wartość V_max pozostaje niezmieniona, ponieważ przy odpowiednio wysokim [S] tak czy inaczej nastąpi całkowite wysycenie enzymu przez substrat.

Kinetyka reakcji dwusubstratowych Michaelisa-Menten - reakcję dwusubstratową sprowadzamy do warunków reakcji jednosubstratowej. Używając wysycającego stężenia jednego substratu, jednocześnie używamy drugiego substratu w stężeniach wymaganych do K_m i V_max i odszukujemy K_mapp (K_m pozorne). Następnie przeprowadzamy reakcję z odwrotnymi proporcjami stężeń.

Stała szybkości k - przybliżenie ułamku substratu, który jest przemieniany w produkt w małym przyroście czasu.
k > 1 · min^-1 oznacza, że więcej niż 100% substratu zostanie zużyte w ciągu minuty, stąd k lepiej wyrażać w s^-1.

Stała substratowa K_s - stała dysocjacji kompleksu ES do E+S. K_S to stosunek iloczynu [E] i [S] do [ES]. K_s = K_m, kiedy stała dysocjacji ES do E+P jest znacznie mniejsza od stałej dysocjacji ES do E+S (czyli K_s).

Prawidłowy pomiar V₀ - pomiar jest wiarygodny, gdy zużycie substratu nie przekracza 10%. Dodanie większej ilości enzymu może doprowadzić do stanu, w którym większość substratu zostanie zużyta, a szybkość reakcji przestanie rosnąć wraz ze wzrostem stężenia enzymu. Stężenie enzymu (pM, nM) winno być na tyle niskie, by zużycie substratu (μM, mM) nie miało znaczenia. Wartość V₀ powinna rosnąć liniowo wraz ze wzrostem stężenia enzymu - odchylenie od liniowości wskazuje na ograniczenia instrumentalne lub środowiskiem reakcji (c substratu, inhibitory, aktywatory). V₀ zależy także od pH roztworu - najwyższych wartości V₀ należy oczekiwać w przedziale pK_a ± 1. Bufory do reakcji enzymatycznej zazwyczaj mają stężenie 0,05 - 0,1M i siłę jonową 0,1 - 0,2M (mała zmiana pH roztworu). Składniki buforu nie powinny fałszować wyników - ich składniki mogą zmieniać V₀. Pehametr należy kalibrować na temperaturę, w której przeprowadzamy badania, ponieważ T również wpływa na pK_a.

Jak postępować, aby białka nie adsorbowały na powierzchni naczyń laboratoryjnych - należy dodać dużo białek inertnych w stężeniu dużo większym niż enzym, np. albumina i żelatyna.

Równanie Michaelisa-Menten - V = (V_max · [S]) / (K_m + [S]).

Wykres Michaelisa-Menten (M-M) - wykres przedstawiający zależność V (oś Y) od [S] (oś X). Pozwala wyznaczyć V_max i K_m (jako V_max / 2).

Wykres Lineweavera-Burke'a (L-B) - wykres służący do wyznaczania V_max i K_m. Na osi X przedstawione są wartości 1/[S], a na osi Y wartości 1/V₀. Punkt przecięcia wykresu z osią Y wskazuje wartość 1/V_max, natomiast punkt przecięcia osi X wskazuje wartość 1/K_m.

Wykres Eadie-Hofstee (E-H) - transformacja równania M-M uzyskiwana przez pomnożenie obu stron równania L-B przez V_max. Wówczas oś X stanowi V₀ / [S], natomiast oś Y - V₀. Punkt przecięcia osi Y wskazuje V_max, krzywa stanowi -K_m, a punkt przecięcia osi X to V_max / K_m. Wykres przydaje się do wyszukiwania odchyleń od liniowości.

Dializa - rozdział mieszanin koloidalnych przy pomocy błony półprzepuszczalnej. Służy do usuwania substancji niskocząsteczkowych.

Chromatografia powinowactwa - metoda wykorzystująca wysoce specyficzne, wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Jedną z nich jest ligand (związany z nierozpuszczalnym nośnikiem), który wiąże drugą substancję, izolując ją z mieszaniny. Substancje pozbawione powinowactwa do ligandu przechodzą przez złoże niezatrzymane. W izolacji enzymów jako ligandy stosujemy analogi substratu, inhibitory, kofaktory, przeciwciała; glikoprotein - lektyny; kwasów nukleinowych - histony, komplementarne sekwencje zasad.

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych - stosujemy wysoko stężone sole, ponieważ rodzaj soli i jej stężenie silnie wpływają na oddziaływanie białko-ligand - im wyższe stężenie, tym więcej białka ulegnie związaniu z ligandem, z kolei jej rodzaj decyduje o selektywności rozdziału. Zależność ilości związanego białka od stężenia soli początkowo rośnie liniowo, później (przy stężeniu soli wywołującym wysalanie białka) wykładniczo, jednak wysalania należy unikać, ponieważ podczas rozdziału jest zjawiskiem niekorzystnym.

Autoradiografia - najstarsza metoda. Ciemnienie kliszy pod wpływem radioaktywnej powierzchni.

Elektroradiografia - nowocześniejsza, skomputeryzowana metoda lokalizacji i ilościowego oznaczania radioaktywności na dwuwymiarowych powierzchniach za pomocą licznika scyntylacyjnego. Wynik podawany jest w cpm (counts per minute).

Krystalografia - analiza struktury kryształów białek. Ujawnia budowę protein na poziomie atomowym.

Kataliza kwasowo-zasadowa - transfer protonów przy udziale grup zasadowych i kwasowych. Przekazywanie protonu z substratu na wystające reszty AA. Może być:

• uniwersalna - donorem/akceptorem protonu jest cząsteczka inna niż woda (np. His w chymotrypsynie);

• specyficzna - H+ i OH- jako grupy kwasowo-zasadowe.

Kataliza nukleofilowa - tworzenie wiązania kowalencyjnego między nukleofilem enzymu i grupą na cząsteczce substratu w stanie przejściowym reakcji. Wiązanie kowalencyjne jest czynnikiem zwiększającym reaktywność stanu przejściowego substratu w stosunku do stanu podstawowego.

Kataliza elektrofilowa - tworzenie kowalencyjnych pośredników między kationowym elektrofilem enzymu, a bogatą w elektrony częścią substratu. Łańcuchy boczne są słabymi elektrofilami, więc rolę elektrofilów odgrywają kofaktory organiczne albo kationowe centra metali.

Reakcja ping-pong (podwójnego przeniesienia) - reakcja, w której przynajmniej jeden z produktów jest uwalniany przed związaniem wszystkich substratów przez enzym. Występuje pośrednia forma enzymu z podstawioną grupą pochodzącą od substratu (czasowa modyfikacja enzymu). Przykładem reakcji ping-pong są reakcje przenoszenia grup aminowych między aminokwasami i ketokwasami (np. po związaniu Asp enzym usuwa z niego grupę aminową, wiążąc się z nią; po uwolnieniu szczawiooctanu przyłączany jest drugi substrat 2-oksoglutaran i, pobierając grupę aminową, staje się ostatecznym produktem reakcji - glutaminianem).

Fluorescencja - rodzaj luminescencji (emisji światła w wyniku innego czynnika niż ogrzewanie ciała). Zjawisko emitowania światła przez wzbudzony atom lub cząsteczkę. Zjawisko uznajemy za fluorescencję, jeśli po zaniku czynnika pobudzającego w ciągu ok. 10^-8 s następuje zanik emisji. Dłuższy czas zaniku emisji oznacza, że mamy do czynienia z fosforescencją. Większość energii ze wzbudzenia ulega rozproszeniu w postaci ciepła. Emitowany we fluorescencji foton ma znacznie mniej energii niż foton wzbudzający, więc maksimum fluorescencji wypada przy dłuższej fali niż maksimum absorpcji (tzw. przesunięcie Stokesa).

Reakcja enzymatyczna wspólna dla produkcji piwa, wina i zakwasu chlebowego - fermentacja alkoholowa (alkohol istotny dla piwa i wina, dla zakwasu - CO₂). ? Babiak napisał, że hydroliza wielocukrów, ale czy przy winie zachodzi?

Dlaczego Hb płodowa ma większe powinowactwo do tlenu niż Hb dorosłych - HbF (płodowa Hb) słabiej przyłącza 2,3-bifosfoglicerynian, który jest allosterycznym czynnikiem zmniejszającym powinowactwo Hb do tlenu. Jest to podyktowane faktem, że HbF musi pobrać tlen z Hb matki.

Dlaczego pomiar aktywności enzymu wymaga bardzo wysokiego stężenia substratu, a pomiar K_m nie - wysokie stężenie substratu decyduje o tym, że wszystkie cząsteczki enzymu są wysycone, a co za tym idzie enzym wykazuje maksymalną aktywność (aktywność rośnie liniowo wraz ze wzrostem zawartości enzymu). Dodatkowo pomiary szybkości początkowej dla różnych stężeń enzymu są wiarygodne tylko wtedy, gdy zużycie substratu nie przekracza 10%. K_m nie zmienia się wraz z [S], a jego wyznaczenie wymaga pomiarów przy kilku różnych [S].

Współczesne metody badań enzymów:

• dichroizm kołowy - badanie II-rzędowej struktury białek na podstawie różnic w absorpcji kołowo spolaryzowanego światła;

• badania w IR - badanie struktury III-rzędowej; poszczególne pasma IR odpowiadają molekularnym wibracjom i oscylacjom łańcucha polipetydowego;

• widmo Ramana - analiza ilościowa i jakościowa roztworów białka na podstawie rozpraszania światła o różnej częstotliwości (widma Ramana);

• site-directed mutagenesis, deletional m. - na podstawie mutagenezy określamy, kiedy enzym traci swą funkcję;

• NMR - badanie struktur przestrzennych białka za pomocą rezonansu magnetycznego;

• spektrometria mas - analiza zjonizowanych form cząsteczek w fazie gazowej.

---