Sylwia Karolczyk
Sprawozdanie z ćwiczeń z „Metodologii badań fitopatologicznych”
Część I Izolacja bakterii z materiału roślinnego
Fragmenty porażonej tkanki roślinnej (liście magnolii) utarto w moździerzu w obecności sterylnej wody
Otrzymano w ten sposób homogenat z utartą tkanką roślinną i zawiesiną bakteryjną
Następnie wykonano dwa posiewy na płytki Petriego. W pierwszej płytce znajdowało się podłoże z KB (King B), a w drugiej podłoże z NB (Nutrient Broth) z agarem. Przy pomocy wyżarzonej w płomieniu palnika ezy pobrano zawiesinę z homogenatu i materiał ten rozprowadzono zygzakowatym ruchem po powierzchni pożywki z KB. Po czym ezę wyżarzono.
Następnie na płytkę z podłożem z NA naniesiono przy pomocy pipety 0,1 ml zawiesiny bakteryjnej w postaci kropli, a następnie wysterylizowaną w ogniu głaszczką rozprowadzono kroplę we wszystkich kierunkach szalki.
Po wykonaniu posiewów szalki przeniesiono do warunków optymalnego wzrostu bakterii. Po kilku dniach (2-3) otrzymano pojedyncze kolonie bakteryjne, które zostały przeniesione do probówek na skosy agarowe, wykorzystane jako materiał podczas dalszych testów fizjologiczno-biochemicznych.
Część II Testy fizjologiczno-biochemiczne umożliwiające identyfikację bakterii
Test LOPAT
- zestaw testów wykonywanych dla Pseudomonas
L (levan production)
→ materiały: pożywka agarowa wzbogacona o sacharozę (+ 50% sacharozy)
→ test ma na celu sprawdzenie, czy badane bakterie mają zdolność przetwarzania nadmiaru sacharozy (ponieważ do powszechnie wykorzystywanej pożywki agarowej dodaje się 1% sacharozy) w wielocukier lewan, tym samym, czy sacharoza stanowi dla nich źródło węgla.
→ wykonanie: oczkiem wyżarzonej ezy pobrano nieco materiału z kolonii bakterii z wcześniej przygotowanych skosów i rozprowadzono niezbyt gęstym zygzakiem na szalce z wyżej wymienioną pożywką. Po czym szalkę przykryto płytką nakrywkową i inkubowano przez kilka dni. Po tygodniu obserwowano wzrost kolonii bakteryjnych.
→ wynik (przedstawia zdjęcie poniżej): Nie dało się obserwować wzrostu typu „wałek” charakterystycznego dla bakterii mających zdolność przetwarzania sacharozy w lewan. Stąd też wniosek, że badana bakteria nie posiada owej zdolności.
O (oxidase production)
→ materiały: 1% wodny roztwór NNN'N' - tetrametylo-p-fenyleno-diamino-dihydrochloru; woda użyta do rozcieńczenia odczynnika - musi być destylowana, nie może zawierać Fe, jednorazowa plastikowa eza.
→ celem testu jest sprawdzenie, czy badana bakteria ma zdolność wytwarzania enzymu - oksydazy, biorącego udział w transporcie tlenu.
→ wykonanie: kilka kropli odczynnika nakroplono na bibułkę na szalce Petriego; Ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu i oczko ezy położono na nasączoną bibułę na szalce, a następnie obserwowano ewentualne reakcje barwne.
→ wynik: po 10 sekundach nie dało się obserwować zmiany zabarwienia materiału, co świadczy o tym, że bakteria nie ma zdolności produkcji oksydazy.
P (pectinolitic activity)
→ materiały: dosyć gruby plaster ziemniaka umieszczony w szalce Petriego z niewielką ilością wody.
→ celem testu jest sprawdzenie, czy badana bakteria wytwarza enzymy pektynolityczne rozkładające tkanki ziemniaka i czy doprowadza do jego zgnilizny
→ wykonanie: wyżarzoną ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu i wbito delikatnie pod kątem prostym w plaster ziemniaka. Po tygodniu obserwowano zmiany jakie zaszły w obrębie tkanek ziemniaka.
→ wynik: w tym przypadku dało się obserwować jedynie miękkie tkanki bezpośrednio w miejscu nałożenia materiału z kolonii bakteryjnej, miejsce wokół niego było twarde. Wynik świadczy o tym, że bakteria przyczynia się do powstania zgnilizny ziemniaka, ale w słabym stopniu.
A (agrinine dihydrolase production)
→ materiały: dwie małe probówki z 1 % argininą (barwa malinowa)
→ celem testu jest sprawdzenie, czy badana bakteria posiada zdolność wytwarzania dihydrolazy argininy, enzymu rozkładającego ten związek, co objawia się zmiana barwy próbki.
→ wykonanie: wyżarzoną ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu i zanurzono w obu probówkach z argininą. Badanie należy wykonać w warunkach beztlenowych, dlatego po wyjęciu ez powinny probówki powinny zostać zalane glicerolem.
→ wynik obserwowany po tygodniu: Nastąpiła zmiana zabarwienia próbki, co świadczy o posiadaniu przez bakterie zdolności produkcji dihydrolazy i rozkładzie argininy.
T (tobaco hypersensibility)
→ testu nie wykonywano
Test na hydrolizę skrobi:
→ materiały: pożywka agarozowa z rozpuszczoną skrobią na szalce Petriego, płyn Lugola
→ test ma na celu sprawdzenie, czy bakteria ma zdolność hydrolizy skrobi
→ wykonanie: Wyżarzoną ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu, a następnie rozprowadzono niezbyt gęstym zygzakiem na pożywce ze skrobią. Szalkę zamknięto szkiełkiem nakrywkowym i inkubowano przez tydzień. Po tygodniu część wyrosłych kolonii usunięto szpatułką, a w to miejsce to nakroplono rozcieńczony płyn Lugola. Zmiana zabarwienia płynu świadczy o hydrolizie skrobi.
→ wynik (zdjęcie poniżej): nie dało się zaobserwować zmiany barwy w miejscu usunięcia kolonii, zatem reakcja jest ujemna, czyli bakteria nie wykorzystała skrobi i nie ma zdolności jej hydrolizy.
Test na utlenianie cukrów:
→ materiały: dwie pożywki: jedna z dodatkiem maltozy a druga z dodatkiem fruktozy
→ celem testu jest sprawdzenie, czy bakteria ma zdolność rozkładu wyżej wymienionych cukrów. Ewentualna zmiana barwy pożywek (obie na początku doświadczenia koloru ciemnofioletowego) świadczy o zmianie zakwaszenia (obniżenie pH z 7,2 na 6,9-7,0) i utlenieniu cukrów.
→ wykonie: wyżarzoną ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu i rozprowadzono niezbyt gęstym zygzakiem na każdej z pożywek (pamiętając o wyżarzaniu ezy każdorazowo w płomieniu palnika). Próbki poddano tygodniowej inkubacji i po tym czasie dokonano odczytów.
→ wynik: na pożywce z maltozą (rysunek poniżej) dała się zaobserwować niewielka zmiana barwy, co może świadczyć o częściowym utlenieniu tego cukru:
W przypadku szalki z fruktozą (zdjęcie poniżej) - nie nastąpiła zmiana zabarwienia, zatem bakteria nie ma zdolności utleniania tego cukru:
Test na redukcję azotanu do azotynu:
→ materiały: pożywka z azotanem
→ celem testu jest sprawdzenie, czy bakteria ma zdolność redukcji azotanów do azotynów, co uwidacznia się zmianą zabarwienia próbki, bo dodaniu „czerwonego” (nie podano nazwy) odczynnika zawierającego fenol
→ wykonanie: wyżarzoną ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu i zanurzono w probówce z azotanem. Poddano tygodniowej inkubacji. Po tym czasie dodano wyżej wymieniony odczynnik
→ wynik (zdjęcie poniżej): nastąpiła zmiana zabarwienia próbki, zatem jest tu obecny azotyn, czyli zaszła redukcja azotanu.
Test GM agar
→ materiały: pożywka w probówce z fioletowym agarem
→ ma na celu sprawdzenie, czy bakteria ma zdolność utleniania glukozy i zdolność ruchu (przemieszczania się w głąb pożywki w probówce). Jeżeli bakteria ma zdolność utleniania glukozy, to próbka się odbarwi, ponieważ jest tu dodany barwnik - błękit bromylowy, który przy spadku pH (powstałym po utlenieniu glukozy) powoduje zmianę barwy na żółtawą. Ponadto jeżeli bakteria ma rzęski to przemieszcza się w głąb pożywki, co spowoduje utlenienie glukozy w głębszych warstwach pożywki i widoczną zmianę zabarwienia. Jeżeli bateria nie ma tej zdolności, to odbarwia się tylko miejsce nałożenia bakterii na słupek
→ wykonanie: naniesienie za pomocą wyżarzonej ezy materiału z kolonii bakterii ze słupka jedynie na wierzch słupka z GM agarem, bez zanurzania ezy wewnątrz pożywki. Po tygodniu obserwacja wyniku.
→ wynik: bakteria jest obecna - rośnie, ale jedynie w powierzchniowych warstwach pożywki, nie nastąpiła też zmiana zabarwienia głębszych warstw. Test można uznać za ujemny, nie wiadome jest, czy bakteria się przemiesza i ma zdolność utleniania glukozy.
Test na rozkład eskuliny
→ materiały: skos agarowy z dodatkiem cytrynianu żelaza i eskuliny
→ celem testu jest stwierdzenie, czy dana bakteria hydrolizuje eskulinę i rozkłada żelazo.
→ wykonanie: na skos z wyżej wymienioną pożywką (barwa słomkowa) zrobiono pasaż koloni ze skosu agarowego przy pomocy wyżarzonej ezy. Po tygodniu obserwowano wynik.
→ wynik: Nastąpiła zmiana zabarwienia pożywki ze słomkowego na ciemnobrązowy (zdjęcie poniżej), co świadczy o tym, że bakteria ma możliwość hydrolizy eskuliny, powstałe związki w obecności żelaza (cytrynian żelaza) utworzyły barwny kompleks. Dodatkowo nie cała eskulina uległa rozkładowi, ponieważ próbka wykazuje niebieską fluorescencję pod wpływem światła ultrafioletowego.
Test rozpuszczalności bakterii w KOH
→ metoda pozwala określić, czy badaniu poddawany jest izolat bakterii Gram-dodatnich (G+) a zatem mają grubszych ścianach, czy Gram-ujemnych (G-) o ścianach cieńszych; metoda ta jest szybsza niż bawienie komórek bakterii metodą Gramma.
→ materiały: 3% wodny roztwór wodorotlenku potasu KOH
→ celem testu jest wykrycie, czy badanie bakterie ulegną rozpuszczeniu, czy nie w roztworze KOH.
→ wykonanie: krople KOH naniesiono na szkiełko podstawowe przy użyciu pipety. Następnie oczkiem wyżarzonej ezy pobrano ze skosu agarowego kolonie bakteryjne, umieszczono oczko w kropli KOH i mieszano w niej przez ponad 10 sekund. Po tym czasie podniesiono ostrożnie ezę.
→ wynik (przedstawia zdjęcie poniżej): po podniesieniu ezy za oczkiem ciągnęła się śluzowata żółtawa substancja o strukturze żelu, świadczy to o tym, że badano izolat bakterii Gram-ujemnych, które ze względu na cienkie ściany uległy rozpuszczeniu w roztworze wodorotlenku potasu.
Test potwierdzający, czy bakteria jest tlenowa czy beztlenowa
→ materiały: woda utleniona
→ wykonanie: kroplę wody utlenionej naniesiono na szkiełko podstawowe a wyżarzoną ezą pobrano materiał z kolonii bakteryjnej ze skosu i oczko ezy włożono do kropli.
→ wynik: po chwili dało się obserwować pienienie (bąblowanie), co świadczy o tym, że bakteria wytwarza enzym katalazę, który bierze udział w transporcie tlenu. Zatem do doświadczenia wykorzystana została bakteria tlenowa.
Obserwacje pod mikroskopem.
→ przygotowanie preparatu mikroskopowego: na szkiełko podstawowe nakroplono wodę, następnie naniesiono niewielką ilość materiału z kolonii bakteryjnej ze skosu, zamieszano i nałożono szkiełko nakrywkowe. Tak przygotowany preparat oglądano pod 40-krotnym powiększeniem pod mikroskopem świetlnym.
→ obraz spod mikroskopu: widoczne pojedyncze komórki bakteryjne, które poruszają się ruchem chaotycznym (ruchy Browna) drgają, a także można uznać, że „płyną”, co świadczy najprawdopodobniej o tym, że posiadają urzęsienie w postaci pojedynczej rzęski osadzonej na biegunie komórki (monotrichalne) lub pojedynczej rzęski na każdym z biegunów komórki (amfitrichalne).