Wykład 11
„Białka”
*Tematem tej części wykładów będą BIAŁKA- historia badań nad nimi, budowa etc. Dokładniej z tematyką zajęć można się zapoznać na slajdzie 4. Ten wykład obejmuje pierwsze trzy podpunkty i częściowo czwarty.
Historia badań nad strukturą białek.
Pokrótce przedstawia ją tabelka z datami zamieszczona na slajdzie piątym.
Ja będę przedstawiać treść wykładu, która mniej więcej ją omawia. Oto i ona:
- Białka zawsze szalenie intrygowały naukowców, ponieważ uważali oni, że kryje się w nich jakaś informacja (genetyczna np.?). Wszystko zaczęło się od badań Fischera, który odkrył, że białka składają się z pojedynczych „cegiełek”- aminokwasów.
- Później rozpoczęły się badania nad ich strukturą przestrzenną z wykorzystanie promieni X. Badano ją z wykorzystaniem preparatów krystalicznych białek, po to by następnie ustalić budowę przestrzenną na podstawie refleksów dyfrakcyjnych promieniowania (zajęło to bardzo dużo czasu zanim te badania dały efekty- 30 lat, aż do lat 50', kiedy odkryto strukturę mioglobiny).
- Białka były dość trudnymi cząsteczkami do analizy, ponieważ z ich budowy nie wynikają żadne potencjalne reguły dotyczące ich budowy i działania (inaczej niż w DNA, gdzie mamy helisę, komplementarność etc.).
- W tym czasie miały również miejsce badania nad oddziaływaniami utrzymującymi tę strukturę. Okazało się, ku zdziwieniu naukowców, że są one dosyć słabe.
- W latach 50' badania nad białkami zbiegły się z tymi dotyczącymi DNA. Ku przerażeniu tych, którzy postulowali, że informacja genetyczna kryje się w sekwencji AA, okazało się (po zsekwencjonowaniu pierwszych białek), że nie ma żadnych reguł nią rządzących, inaczej niż w przypadku sekwencji zasad W DNA.
- Pewnych stałych motywów można doszukać się jedynie w krótkich peptydach, które składają się na całą cząsteczkę białka; badania Paulinga i Coreya prowadzone w tym zakresie wykazały, że sprawa nie jest beznadziejna i występują w białkach stałe elementy.
- W efekcie, w 1961 roku Afinsen sformułował hipotezę, że struktura białek jest zapisana w ich sekwencji AA i można na jej podstawie wnioskować o właściwościach tych cząsteczek. Wnioskował to na podstawie badań prowadzonych nad rybonukleazą, która jest łatwym białkiem do analizowania, bo albo działa albo nie w zależności od środowiska - można ją unieczynnić dodając mocznika. W obecności tego związku cząsteczka traci strukturę przestrzenną i właściwości enzymatyczne, efekt jest znoszony po usunięciu go z roztworu.
- Bezpośrednią konsekwencją a zarazem przełomem w badaniach nad białkami było odkrycie przez Sangera metody sekwencjonowania białek, która umożliwiła nie tylko poznanie składu aminokwasowego cząsteczek, lecz także ich budowy i właściwości.
- Od tamtej pory następowało sukcesywne doskonalenie technik badania białek tj. NMR (Ernst).
- W kręgu zainteresowań w II połowie XXw znalazło się uzyskiwanie białek rekombinowanych, które dziś są produkowane na dużą skalę (pod koniec lat 70'). Poza szeregiem innych zastosowań również to osiągnięcie nauki umożliwiło poznanie struktury i właściwości białek, szczególnie tych, które występują w organizmie w niewielkich ilościach.
- Również badania sekwencji genomów dostarczyły wielu informacji na ww. temat, w efekcie wyparły nawet metodę Sangera, gdyż kwasy nukleinowe łatwiej badać niż białka.
CEL WW. BADAŃ=POZNANIE STRUKTURY POJEDYNCZEGO BIAŁKA.
- Na przełomie lat 80' i 90' pojawił się drugi kierunek badań nad białkami. Zaczęto patrzeć na białka występujące w komórce bardziej holistycznie i zaczęto starania, by poznać wszystkie produkowane przez nią białka i relacje między nimi.
- Rozpoczęła się w ten sposób era badań systemowych, mających na celu poznanie wszystkich białek wielu organizmów, a wcześniej genów, transkryptów, fenotypów etc.
- Ta nowa dziedzina została nazwana PROTEOMIKA (= badanie wszystkich białek komórki jednocześnie, poznanie języka białek, określanie potrzeb białek i modyfikacji, jakim ulegają, jest to cel nr 1 tych Bad ań).
-Badaczy bardzo interesowały źródła różnorodności (cel nr 2 tych badań) - liczba występujących w genomach ORF-ów, alternatywny splicing, modyfikacje posttranslacyjne, np. chemiczne.
-Dziś obie dziedziny (proteomika i badania strukturalne) mają się dobrze.
Aminokwasy:
Polecam przejrzenie slajdów od 8, tam przedstawione są AA po tysiąckrotnie w różnych konwencjach.
Można sobie przypomnieć wiele informacji nt. AA, do których ja nie będę już szczegółowo opisywać, ponieważ były one poruszane wiele razy na innych wykładach.
- Aminokwasy występujące w białkach są L -aminokwasami, chociaż w organizmach występują także -aminokwasy, jako metabolity pośrednie różnych szlaków, np. -alanina. Z kolei ornityna jest -aminokwasem, jednakże nie wchodzi w skład białek, pozostając jedynie metabolitem pośrednim cyklu mocznikowego.
- AA mają wspólny motyw budowy - węgiel , który (poza glicyną) jest połączony z 4 rożnymi podstawnikami - atomem H, grupą karboksylową, aminową oraz R - podstawnikiem, który decyduje o właściwościach cząsteczki.
- Jak w przypadku innych związków posiadających środek symetrii, są dwa szeregi AA L- występujące powszechnie w organizmach, i D- występujące rzadziej, u mikroorganizmów np.
- Istnieją różne konwencje i schematy przedstawiania AA i innych związków organicznych (np. S= żółty kolor, C- biały, N- niebieski, O- czerwony).
- Powszechnie przyjmuje się, że w białkach występuje 20 aminokwasów (należy pamiętać, że z różną częstością w poszczególnych białkach, jedne występują częściej, inne rzadziej).
- Dzieli się je ze względu na:
Posiadanie lub brak ładunku - decyduje o tym R; przyjmują ładunek +, - (razem 5 AA - His, Asp, Glu, Arg, Lys) lub żadnego; AA polarne są ważne w tworzeniu mostków solnych niezbędnych do stworzenia struktur przestrzennych białka.
Polarność - jest istotna w trakcie zwijania białek, ponieważ decyduje o oddziaływaniu z rozpuszczalnikiem, w którym się to odbywa (wodą); AA niepolarne mają liczne atomy C w łańcuchu bocznym, poza Trp; atom N występujący w lańcuchu boczny Trp czasem tworzy wiązania wodorowe (por. później); polarne posiadają N lub O (zdolne do tworzenia wiązań wodorowych) w większej ilości.
Wielkość - dokładniej chodzi nie tylko o to czy R jest mały (Gly) lub duży (Trp), ale także o długość i rozbudowanie w przestrzeni łańcuch bocznego; jest to niezwykle istotne w procesie upakowywania cząsteczki w przestrzeni (stopień upakowania jest określany przez stosunek wszystkich promieni vanderwaalsowskich ;> do objętości cząsteczki), widać to szczególnie w przypadku białek zmutowanych, gdzie AA duży, rozbudowany został zamieniony na mały - to powoduje problemy z przyjęciem właściwej organizacji przestrzennej.
Hydrofobowość - czyli tendencja do tworzenia wiązań wodorowych z rozpuszczalnikiem lub innymi elementami łańcucha (ad. slajd 16).
Posiadanie pierścienia - jest ono szczególnie ważne, ponieważ pierścienie mogą ze sobą oddziaływać na dwa sposoby (por. później), co pozwala na silniejsze utrzymywanie struktury przestrzennej.
- Nie jest jednak tak, że każdy AA jest inny. Przeciwnie, ich właściwości nakładają się na siebie i mogą się nawzajem zastępować, zwłaszcza te występujące w obrębie zewnętrznej (między sobą) i wewnętrznej (również wzajemnie) części cząsteczki oraz małe na małe i duże na duże.
- Ogólnie rzecz biorąc w białkach występuje - z różną częstością (slajd 19) - 20 aminokwasów. Jednakże łagodna hydroliza białek wykazuje obecność dodatkowych:
Fosfoseryna
Fosfocysteina
Fosfotreonina
Metylolizyna
Te dodatkowe aminokwasy biorą się z posttranslacyjnej modyfikacji białek, nie mają własnych kodonów. Swoje kodony mają dokładnie 22 AA, w tym tylko podstawowe 20 występuje powszechnie. Pozostałe dwa są rzadkie, a sposób ich włączania niezwykły. Są to:
Selenocysteina - występuje w takich białkach jak peroksydaza glutationowa, selenoproteina p; posiada własne tRNA, UAG, który normalnie oznacza „STOP”; gdy w komórce jest mało selenu, translacja jest hamowana właśnie dzięki stopującej roli UAG, natomiast w sprzyjających warunkach, gdy jest selen, na RNA tworzy się struktura „szpilki do włosów” w skutek czego włączana jest w kodonie „STOP” seryna, która następnie modyfikowana jest przez szereg białek do selenocysteiny. Zatem cechami tworzenia tego AA są:
*uzależnienie od obecności selenu
*wieloetapowość
Pirolizyna - wykryto ją tylko u pewnego archeona; do grupy -NH3+ przyłączony jest pierścień pirolowy; kodowana jest przez inny „STOP” - UGA; by została włączona konieczne jest stworzenie struktury drugorzędowej RNA.
3.Oddziaływania w łańcuchach polipeptydowych:
Ostatni, 3 temat wykładu.
Slajdy od 20
Na początek kilka truizmów, krótko :
- W łańcuchu aminokwasy połączone są wiązaniem peptydowym, tworzonym z wytworzeniem cząsteczki wody.
- Łańcuch posiada strukturę przestrzenną, która jest utrzymywana przez słabe oddziaływania innego typu (1929, Hsien Wu
).
- Wiązania w łańcuchu dzielą się na:
SILNE - do nich należą wiązania peptydowe występujące jak już wspomniałam w łańcuchu peptydowym oraz wiązania disiarczkowe między grupami -SH cysteiny (powstaje ono na skutek reakcji utlenienia tych grup - mają dość dużą energię, ok. 50 kcal na mol, mogą występować w obrębie łańcucha bądź między łańcuchami, jak w insulinie). Na tworzenie się mostków S-S ma wpływ szereg czynników tj. potencjał oksydoredukcyjny wokół cząsteczki, temperatura, siła jonowa roztworu, pH, właściwości białka . Jeżeli taką strukturę podda się redukcji, następuje nieodwracalna denaturacja cząsteczki lub jej rozpad, kiedy dotyczy to dwu łańcuchów połączonych tym typem wiązań.
SŁABE - ich energia jest porównywalna z energią ruchów termicznych. Są to:
mostki solne - występują między grupami aminowymi i karboksylowymi, występującymi w łańcuchach bocznych aminokwasów kwaśnych i zasadowych oraz między tymi grupami występującymi na końcach łańcucha.
wodorowe - jedno z kluczowych dla przestrzennej konstrukcji białek oddziaływań; ich siła zależy od wzajemnego ułożenia atomów (kąta - ułożone pod kątem są słabsze); występują między:
elementami łańcucha głównego, grupami -NH oraz =O, które powstały w wyniku tworzenia wiązań peptydowych, są dołączone do C
elementami łańcuchów bocznych - oddziałują ze sobą -OH Ser i -NH3+ Lys.
elementami mieszanymi ww.
3. komponenta hydrofobowa - związana z przyleganiem do siebie powierzchni w
obrębie cząsteczek oraz między nimi (generalnie chodzi o to że, hydrofobowe fragmenty cząsteczki grupują się i w ten sposób białko się zwija); przykładem struktury tworzonej przez oddziaływania hydrofobowe jest „kieszeń hydrofobowa”- tworzą ją trzy położone daleko od siebie w łańcuchu, blisko natomiast w przestrzeni; do takiej kieszeni („norki”) wchodzi hydrofobowa Met.
(hmmm... nie mam już więcej nic ciekawego do powiedzenia nt. tej struktury, jakkolwiek powyższy opis jest enigmatyczny; mnie osobiście rozbraja nazwanie jej norką, bo to cytat ze Staronia, który jakoś tak mi się kojarzy z hobbitem; dodam, że to b. ważne energetycznie oddziaływania ;/)
4. oddziaływania van der Waalsa - działają jedynie w ściśle określonej,
niewielkiej odległości - zbliżanie oddziałujących powierzchni powoduje ich odpychanie; są związane z komplementarnością powierzchni białek, ważne oddziaływania powierzchniowe.
5. oddziaływania między AA aromatycznymi - między sobą, a dokładnie między elektronami zdelokalizowanego wiązania oraz między ww. elektronami a dodatnio naładowanymi grupami aminowymi.
( to wszystko, co było mówione na wykładzie przez Staronia; dodatkowe informacje - wizualizacje, energie wiązań, znajdziecie w slajdach, do 31 dokładnie).
- Nie jest przypadkiem, że to słabe oddziaływania są kluczowe dla formowania się białek. Białka aby móc pełnić ważne funkcje w organizmie muszą mieć łatwą do modyfikacji strukturę, np. zmiany pod wpływem ATP nie mogłyby następować, jeśli oddziaływania byłyby silniejsze. Podobnie transport - silne wiązania uniemożliwiałyby rozfałdowanie białka podczas transportu.
- Strukturę cząsteczki białka można przedstawiać na wiele różnych sposobów (slajd 33), w zależności od tego, na które atomy lub grupy chcemy zwrócić uwagę.
- W 1952 roku Lang orzekł, że w strukturze białek można się doszukać hierarchiczności. I tak wyróżniamy: strukturę pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędową.
- Struktura pierwszorzędowa to ułożenie w łańcuchu kolejnych AA; wewnątrz łańcucha wyróżniamy monotonnie (to nie moje określenie - białka - monotonne - NIGDY!) powtarzający się motyw, na który składają następujące kolejno po sobie C-C=O (atom należący pierwotnie do grupy karboksylowej)-N-H (wcześnie gr. aminowa); łańcuchy boczne sterczą na zewnątrz.
- Ułożenie AA w przestrzeni nie jest niczym nieograniczone. Między ww. trzema atomami łańcucha głównego występują trzy kąty (z punktu widzenia atomu C
między C a NH- kąt
między C a C=O -
miedzy C=O a NH -
- Wiązanie peptydowe między C=O a NH ma charakter pośredni miedzy pojedynczym i podwójnym, dlatego jest dosyć sztywne. Połączone z nimi atomy C mogą występować w dwu konformacjach - cis (rzadziej, głównie tam, gdzie ciągi prolinowe) i trans (częściej, ze względu na korzystniejszą energię).
- Trochę bardziej skomplikowana jest sytuacja w przypadku pozostałych kątów; jednak jeśli je znamy to w połączeniu z informacją nt. (standardowo 90st.) dają nam możliwą konformację całej cząsteczki.
- Dzieje się tak ze względu na to, że kąty i nie mogą przyjmować dowolnych wartości, ze względu na niekorzystne oddziaływania steryczne atomów należących do łańcucha bocznego.
- Możliwe wartości tych kątów przedstawione są na wykresie zależności Ramachandrana (slajd 38). Jest on oczywiście pewnym uogólnieniem, ponieważ wnioski wysuwano na podstawie łańcucha polialaninowego, a alanina ma stosunkowo mały łańcuch boczny. Dla Gly istnieje więcej możliwych konformacji, a dla Pro- mniej.
- Występujące na wykresie „plamy” przedstawiają zakres możliwych konformacji i pokrywają się z występującymi naturalnie w białkach strukturami wyższego rzędu- helisą i - kartką. „Białe miejsca” to zakresy niedozwolone, gdzie odległości miedzy atomami są mniejsze niż promienie van der Waalsa.
- Ze względu na opisane przeze mnie ograniczenia bardzo ważne są AA mogące przyjmować nietypowe konformacje - prolina o sztywnym i płaskim łańcuchu oraz malutka glicyna.
- W miejscach cząsteczki bogatych w prolinę występuje najczęściej tzw. HELISA Pro, gdzie co czwarta prolina ułożona jest w tej samej płaszczyźnie (slajdy 42 i 43). Tworzy się w ten sposób zagłębienie dla innych hydrofobowych AA.
- Łańcuchy boczne mogą przyjmować różne mniej lub bardziej korzystne energetycznie konformacje.
(UWAGA! UWAGA! Jak wspominałam na początku, Staroń zaczął kolejny temat o strukturach drugorzędowych = fragment o helisie. Ja postanowiłam tego nie umieszczać by wykład stanowił pewną całość, a informacje nie powtarzały się, ale dopilnuję, by osoba z następnym wykładem umieściła te informacje!)
4