1.STREPTOCOCCUS PYOGENES

- diagnostyka opiera się na badaniu mikroskopowym oraz izolacji i identyfikacji zarazka. Badania serologiczne (wykrycie antystreptolizyny O > 200j/ml to zakażenie) stosuje się przede wszystkim w wykryciu choroby reumatycznej. Najczęściej badanymi materiałami są wymazy z gardła i nosa ( rzadziej bada się ropę, plwocinę, krew ).Badanie metodą Grama (Gram+ niebieskie) jest badaniem wstępnym ale mającym istotne znaczenie. Nie wykonuje się bezpośrednich preparatów z wydzielin jamy nosowo-gardłowej ponieważ zawsze są tam dostępne paciorkowce zieleniejące (normalna flora bakteryjna).Badane materiały wysiewa się na agar z krwią i podłoża namnażające (bulion Todda-Hewitta lub cukrowy) W przypadku zakażeń uogólnionych pobiera się krew którą w ilości 10 ml posiewa się na 100ml podłoża płynnego lub półpłynnego. Hodowlę prowadzi się w warunkach tlenowych i beztlenowych. Materiały, które zawierają oprócz paciorkowców różnorodną florę bakteryjną, należy wysiewać na agar z krwią i podłoża selektywne (podłoże Pike'a, podłoże Holmesa i Termita i inne ) Posiew na pożywki beztlenowe wykonuje się w przypadku klinicznego podejrzenia zakażenia wywołanego paciorkowcami beztlenowymi albo obecności paciorkowców w preparacie mikroskopowym przy jednoczesnym braku wzrostu lub gdy materiał wydziela przykrą woń charakterystyczną dla beztlenowców. Dalsze różnicowanie polega na określeniu ich przynależności grupowej metodą precypitacji ,immunofluorescencji lub stosując test z bacytracyną (grupa A wrażliwa). Następnym etapem (po izolacji i identyfikacji) jest wykonanie antybiogramu ( grupa A wrażliwa na antybiotyki ). Paciorkowce ropne są wrażliwe na wiele antybiotyków (z wyboru stosuje się penicylinę a w przypadku uczulenia erytromycynę, linkomycynę, klindamycyę lub cefalosporyny)

2. NEISERIA GONORHEAE

- materiałem do badań : mężczyźni - wymaz lub wyciek z cewki moczowej, kobiety: materiał z cewki, wymaz z szyjki macicy i często z odbytu. Rozpoznanie rzeżączki opiera się na badaniach mikroskopowych i hodowlanych. Mikroskopem bada się najczęściej ropę i różne wydzieliny. Preparat barwi się metodą Grama ( G- różowe dwoinki ułożone wewnątrz leukocytów wielojądrzastych. U kobiet przyczyną trudności w mikroskopowym rozpoznaniu rzeżączki jest naturalna flora bakteryjna ( także rzeżączka przewlekła). We wszystkich przypadkach,gdy wynik jest ujemny lub wątpliwy należy wykonać posiew materiału na podłoże Peizzea-Stefena (bulion trypsynowany +agar + plazma końska) lub na agar czekoladowy i na podłoże selektywne (podłoże z dodatkiem antybiotyków). Po wyosobnieniu na podłożu stałym kolonii ( owalny kształt występują pojedynczo lub w czwókach , nie mają otoczek) przeprowadza się próbę na oksydazę ( oksydazododatnie czerwone które stopniowo przechodzi w brunatnoczarny ) Gonokoki nie rosną na podłożu zwykłym i w temp. 22C. Rozkładają tylko glukozę i dają dodatni odczyn immunofluorescencji z surowicą przeciwgonokokową. W diagnostyce rutynowej można wykonać odczyn wiązania dopełniacza w celu wykrycia przeciwciał w surowicy chorych. Dwoinka rzeżączki jest wrażliwa na działanie antybiotyków ( np. erytromycynę, doksycyklinę) Od dawna stwierdza się szczepy sulfonamidooporne.

3. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

- rodzaj materiału przesyłanego do badań zależy od tego jaki narząd został zajęty ( np. plwocina, wymazy z gardła i nosa, ropa, mocz , płyn mózgowo-rdzeniowy, popłuczyny żołądkowe).Do badania rzadko przesyła się krew. Im krótszy czas między pobraniem do zakażenia hodowli tym większe jest prawdopodobieństwo wyhodowania prątków.

a.) badania mikroskopowe ( preparaty barwi się metodą Ziehla-Neelsena (prątki zabarwiają się na kolor czerwony). Stosuje się coraz częściej metodę fluorescencji ( barwiąc preparat roztworem fenolu i auraminy- żółte; lub oranżem akrydyny - czerwone; reszta na zielono)

b.) posiew materiału - jeśli materiał zawiera towarzyszącą prątkom inną florę bakteryjną, należy materiał homogenizować. Zakłada się hodowlę. Materiały, które normalnie są jałowe wysiewa się na zwykłe podłoża bakteriologiczne, aby upewnić się o ich jałowości i nie poddaje się ich homogenizacji. Następnie materiał (po homogenizacji i neutralizacji ) posiewa się na kilka próbek z podłożem Loewensteina .Komórki zabezpiecza się przed wyschnięciem, wkłada na kilka tygodni do termostatu. Co tydzień przegląda się hodowlę i z podejrzanych koloni wykonuje się preparat. Kolonie rosną w postaci charakterystycznych brodawkowatych, kremowych kolonii.

c.) próby biologiczne-materiał homogenizowany można zaszczepić świnkom morskim w okolicę węzła pachwinowego. Szczepi się zawsze dwie świnki, obserwując je od chwili zakażenia. Świnka po kilku tygodniach zmniejsza wagę, jest osowiała, sierść jej matowieje. Po 3 tygodniach od momentu zakażenia robi się pierwszą próbę tuberkulinową.O dodatniej próbie tuberkulinowej zawiadamia się lekarza,a świnkę obserwuje się w dalszym ciągu.Gdy świnki padną po około 6-8 tyg., wykonuje się sekcję. Jeśli przeżyją zabija się jedną po 6, a drugą po 12tyg..

W narządach stwierdza się charakterystyczne dla gruźlicy zserowaciałe gruzełki, następnie sporządza się z nichpreparaty mikroskopowe i stwierdza obecność prądków kwasoodpornych.

d) różnicowanie szczepów- próba biologiczna pozwala odróżnić Mycobacterium tuberculosis od Mycobacterium bovis .Do szczepienia wykorzystujemy królika,który jest mało wrażliwy na zakażenie Myc.tuberculosis ,natomiast po zakażeniu Myc.bovis stwierdza się u niego spadek wagi i po około 12 tygodniach stwierdza się u niego rozległe zmiany we wszystkich narządach, szczególnie w płucach, pokrytych typowymi gużliczymi gruzełkami.

Szczepy można różnicować na pożywce z czerwienią bromokrezolową Wagnera-Mitscherlicha. Pożywka ma kolor niebieski i Myc. tuberculosis zmienia po 3-8 tygodniach podłoże na kolor żółty. Myc.bovis nie powoduje zmiany zabarwienia. Reakcja polega na utlenieniu gliceyny i powstawaniu wolnego kwasu.Myc.bovis nie utlenia gliceryny, wobec tego pożywka barwy nie zmienia.

e) badania serologiczne-serologia nie odgrywa w gruźlicy większej roli. Jedyny odczyn o pewnym znaczeniu to hemaglutynacja Middlebrooka-Dubosa. Odczyn jest swoisty, ale mało czuły.

f)próby tuberkulinowe- stosuje się u ludzi, jak i u zwierząt, które są najpraktyczniejszym i najbardziej budzącym zaufanie testem immunologicznym w gruźlicy. Można ją wykonać różna techniką przez: skaryfikację, wykonanie próby skórnej, śródskórne wstrzyknięcie tuberkuliny. Próba tuberkulinowa może być ujemna u ludzi, którzy nie byli narażeni na zakażenie, lub u których się jeszcze nie wytworzyła nadwrażliwość. Próba jest ujemna u ludzi starszych wyniszczonych inną chorobą, lub u chorych u których stosuje się leki przeciwhistaminowe lub kortykosteroidy. Brak zdolności reagowania na tuberkulinę może być spowodowany brakiem limfocytów T w ustroju.

Wrażliwość na leki. Prątki są wrażliwe na streptomycynę, hydrazyd kwasu izonikotynowego (INH) i kwas p-aminosalicylowy (PAS). Mogą mieć jednak naturalną, pierwotną odporność na antybiotyki i chemioterapeutyki, mogą ją nabyć również wtórnie podczas leczenia. Dlatego stosuje się leczenie skojarzone kilkoma antybiotykami i chemioterapeutykami. Jeśli leki są żle tolerowane lub jeśli prątki utraciły na nie wrażliwość stosuje się leki zastępcze. Należą do nich antybiotyki: wiomycyna, kapromycyna, cykloseryna, kanamycyna, ryfampicyna, lub leki syntetyczne: etionamid, etambutol i pirazynamid.

4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA

-materiał do badań : płyn mózgowo rdzeniowy, kał. Rozpoznanie zakażenie wymaga hodowli i izolacji zarazka. Badania szczegółowe :wzrost mgławicowy,charakterystyczny barwnik, zapach, nie rozkładają laktozy.

5. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

- materiał do badań : plwocina i próbki krwi żylnej .Wykonuje się hodowle i izolacje .Próbka plwociny powinna być barwiona metodą Grama. Identyfikacja : test wrażliwości na optochinę, test rozpuszczalności w żółci , testy serologiczne ( reakcja pęcznienia otoczek ). Lekowrażliwość : penicylina ( izoluje się szczepy oporne ), trzecia generacja cefalosporyn,wankomycyna

6. MYCOPLAZMA PNEUMONIA

- materiał do badań: plwocina, wymazy lub popłuczyny z jamy nosowo-gardłowej. Po przygotowaniu materiału i odrzuceniu naturalnej flory, można wykonać posiew na pożywkę płynną i stałą, na hodowlę komórek, lub zakażać zwierzęta laboratoryjne. Obowiązkowe testy biochemiczne : rozkład glukozy, hydroliza argininy, hydroliza mocznika, biosynteza karotenoidów . Badania serologiczne- wykonuje się OWD ( hodowla na agarze albo z zakażonych komórek), badanie poziomu zimnych aglutynin (w atypowych zapaleniach płuc we krwi chorego pojawiają się izoaglutyniny aglutynujące krwinki ), odczyn neutralizacji. Bakteria jest wrażliwa na antybiotyki o szerokim zakresie działania oraz na działanie erytromycyny.

7. STAPHYLOCOCCUS SAPROPHITICUS

- materiał do badań: mocz i ewentualnie ropa. Rozpoznanie zarazka opiera się na : badaniu mikroskopowym i izolacji zarazka z określeniem jego właściwości chorobotwórczych. W preparacie barwionym metodą Grama obserwuje się Gram dodatnie ziarniaki często ułożone w postaci gron.Najważiejszym badaniem jest izolacja. Materiały wysiewa się na agar z krwią i podłoża wybiórczo-różnicujace (np. podłoże Chapmana, Zebovitza ) czasem stosuje się płynne podłoża wybiórczo różnicujące. Na p. stałych gronkowce wytwarzają charakterystyczne kolonie. Gronkowce łatwo nabywają łatwo oporność na antybiotyki.Lekami z wyboru są penicyliny naturalne zwłaszcza półsyntetyczne oraz np. cefalosporyny, doksycyklina,erytromycyna.

E.coli: hodowla i izolacja ( materiał: mocz ). Podłoże MacConkeya które zawiera laktozę i wskaźnik pH. Analiza biochemiczna i serotypowanie.

8. Haemophilus influaenzae

MATERIAŁ:

Krew, płyn m-r, ropa, plwocina

PREPARTAT:

Barwienie metodą Grama

Szukamy G(-) krótkich pałeczek silnie wybarwionych na biegunach o charakterystycznym ułożeniu

(Z płynu m-r i ropy wykonuje się również preparaty przy uzyciu fluoryzującej surowicy odpornościowej)

HODOWLA

Posiew na pożywki specjalne( agar z krwia, agar czekoladowy) szczególnie na podłoże Lewinthala

IDENTYFIKACJA

1. Odczyn aglutynacji z surowicą specyficzną(odczyn aglutynacji lateksu)

2. Próby biochemiczne:

- redukują azotany do azotynów

- nie hemolizują krwi

- nie dają odczynu hemaglutynacji

- rozkładają glukozę, ksylozę i mocznik

- wytwarzają indol

c) Serologia:

- reakcja pęcznienia otoczek

- bezpośrednia fluorestencjia (wprowadzenie p/ciał znakowanych fluoresceina przeciwko H. influenzae)

LEKOWRAZLIWOŚĆ:

- cefalosporyna III generacji, - amoksycylina+ kw. Klawulonowy

- chloramfenikol - ampicylina lub amoksycylina

- tetracykliny - sulfonamidy

9. Streptococcus pneumoniae

MATERIAŁ

Wysięki, ropa, krew płyn m-r,

PREPARAT:

Barwienie metoda Grama, i metodami służącymi do wykrywania otoczek (metody negatywno- pozytywne)

Szukamy G (+) dwoinek podobnych do płomyków świec zwróconych do siebie podstawami)

HODOWLA:

Posiew na podłoża wzbogacone (agar z krwią, bulion pneumokokowi)

IDENTYFIKACJA:

1. próba z optochiną ?(zahamowanie wzrostu)

2. próba rozpuszczalności w żółci (bardzo szybko rozpuszcza się w żółci w przeciwieństwie do innych paciorkowców

3. Serologia (rzadko)

- r-cja pęcznienia otoczek

LEKOWRAŻLIWOŚĆ

- penicylina - cefalosporyny III g.

- wankomycyna - sulfadiazyna

- aureomycyna

ZALECA SIĘ WYKONANIE ANTYBIOGRAMU

10. Staphylococcus aureus

MATERIAŁ:

Ropa, krew, płyny wysiękowe, plwocina, wymazy z nosa, gardła, kał, mocz, żółć, płyn m-r

PREPARAT:

Barwienie metodą grama.

Widoczne ziarniaki położone wewnątrz lub zewnątrz leukocytów

HODOWLA

Podłoże agar z krwią i bulion

podłoże Chapmana - rozkład mannitolu

podłoże McConkey'a - wzrastają na nim pałeczki

Podłoża wybiórczo różnicujące:

- z 7,5% NaCl hamują wzrost innych drobnoustrojów

- z 40% żółcią

- agar z solą i mannitolem

Wygląd kolonii:

- średnica 1-3 mm

- kolonie okrągłe, gładkie, wypukłe, błyszczące, wilgotne

- zabarwione na kolor złoty, biały, lub żółty

IDENTYFIKACJIA:

- hemoliza β na agarze z krwią

- próba na koagulazę ( koagulazo (+) ) - powoduje krzepnięcie osocza

- fermentacja mannitoluh

- Clumping Factor

- paski Api

LEKOWRAZLIWOŚĆ:

Antybiogram: metoda dyfuzyjno -krażkowa

Oporne na większośc antybiotyków β- laktamowych

Stosuje się:

- cefalosporyny I generacji

11. Clostridium botulinum

(G(+), bezotoczkowa, urzęsiona), wytwarza zarodniki)

MATERIAŁ:

Krwe (przed podaniem anatoksyny), resztki jedzenia, treść żołądka, wymiociny

PREPARAT:

-

HODOWLA:

Izolacja laseczek z resztek pokarmowych itd. trudna i rzadko stosowana.

Badanie biologiczne:

Z resztek pokarmowych:

Zaraża się myszki lub świnki morskie

Jedno zwierzę zakażamy dootrzewnowo przesączem pokarmu lub wymiocin.

Drugie materiałem zmieszanym z antytoksyczną surowicą lub ogrzanym w ciągu 30 min w 100°C.

Padają zwierzęta zakażone (pierwsze) a zwierzęta z antytoksyna przezywają.

SEROLOGIA:

Metoda podwójnej precypitacji w żelu agarozowym.

LEKOWRAŻLIWOŚĆ:

- Podawanie antytoksycznej surowicy

- z wyboru penicylina

12.Salmonella enteritidis

MATERIAŁ:

Kał, wymiociny, treść dwunastnicza, krew, mocz, żółć, ropa, płyn m-r, plwocina

PREPARAT:

(-)

HODOWLA:

- podłoże namnażające z kwaśnym selenianem sodu

(w cieplarce przez 24h)

↓

- podłoża wybiórcze:

- SS

- Mc Conkey (fermentacja laktozy)

- Wilson Blaira

ROŻNICOWANIE:

Kolonie: - okrągłe

- gładkie, lśniące, przejrzyste - forma S

- szorstkie, matowa, płaskie, suche- forma R

IDENTYFIKACJA:

- krótki szereg biochemiczny:

- podłoże Kliglera

- 10% laktoza

- woda peptonowa z tryptofanem (tworzy H₂S )

- podłoże Singera

SEROLOGIA:

- określenie struktury antygenowej

- aglutynacja szkiełkowa z poliwalentną surowicą odpornościową (HM)

- odczyn aglutynacji Wiedala (od 6 dnia choroby

- OWD z antygenem poliwalentnym

- odczyn precypitacji surowicy z endotoksyną

LEKOWRAZLIWOŚĆ

- leczenie wspomagające

13.Clostridium tetani

MATERIAŁ:

Z rany, krew - pobieramy przed podaniem anatoksyny

PREPARAT:

- pałeczki dobosza, wyglądają jak lizak albo rakieta do tenisa

HODOWLA:

Przed posianiem ogrzewamy w temp. 80°C przez 20 - 30 min

Podłoża:

- Tarozzi- Wrzosek

- Podłoże z tioglikanem sodu

- Agar Zeisslera

KOLONIE:

- nieduże, szarawe, o nieregularnych brzegach, po kilku dniach hemoliza α→β

IDENTYFIKACJA:

- przykry zapach z rany (zapach gnilny)

Metoda biologiczna:

Myszka Myszka

+ +

Toksyna anatoksyna królicza

Kilka ↓ ↓

godz DEAD LIVE

LEKOWRAZLIWOŚĆ:

- penicylina i inne antybiotyki o szerokim spektrum

- anatoksyna tężcowa i Ig tężcowe

14.Treponema pallium (kiła I rz.)

MATERIAŁ:

Płyn surowiczy z wrzodu twardego

PREPARAT

Nie zabarwione krętki w ciemnym polu widzenia(spiralne świecące nitki o charakterystycznym ruchu)

LUB

Barwienie tuszem chińskim i oglądnie pod immersją

HODOWLA

-

IDENTYFIKACJA:

a) testy serologiczne: swoiste(immunofluorestencja) i nieswoiste(z kardiolopiną, odczyn Wassermana, odczyn flokulacji)

LEKOWRAŻLIWOŚĆ:

Penicylian, tetracykliny, chloromycetyna, erytromycyna, rowamycyna

15. Terponema pallium (kiła II rz.)

MATERIAŁ:

Płyn surowiczy z wrzodu twardego, ze zmian w błonie śluzowej jamy ustnej i narządów płciowych)

PREPARAT

Nie zabarwione krętki w ciemnym polu widzenia(spiralne świecące nitki o charakterystycznym ruchu)

LUB

Barwienie tuszem chińskim i oglądnie pod immersją

- HODOWLA

-

IDENTYFIKACJA:

1. testy serologiczne:

*nieswoiste

- REAGINY- OWD: odczyn Wassermana, Odczyn Kolbera (zmodyfikowany Wassermann),

- odczyn flokulacji (inaczej odczyn Kahna) i mikroflokulacji (VDRL i Kline)

* swoiste

- OWD, immunofluorestencjia, immobilizacja i odczyn Nelsona- Mayera

LEKOWRAŻLIWOŚĆ:

Penicylian, tetracykliny, chloromycetyna, erytromycyna, rowamycyna

16. Staphylococcus aureus:

MATERAIŁ:

Ropa, krew, płyny wysiękowe, plwocina, wymazy z nosa, gardła, kał, mocz, żółć, płyn m-r

PREPARAT:

Barwienie metodą grama.

Widoczne ziarniaki położone wewnątrz lub zewnątrz leukocytów

HODOWLA

Podłoże agar z krwią i bulion

podłoże Chapmana - rozkład mannitolu

podłoże McConkey'a - wzrastają na nim pałeczki

Podłoża wybiórczo różnicujące:

- z 7,5% NaCl hamują wzrost innych drobnoustrojów

- z 40% żółcią

- agar z solą i mannitolem

Wygląd kolonii:

- średnica 1-3 mm

- kolonie okrągłe, gładkie, wypukłe, błyszczące, wilgotne

- zabarwione na kolor złoty, biały, lub żółty

IDENTYFIKACJIA:

- hemoliza β na agarze z krwią

- próba na koagulazę ( koagulazo (+) ) - powoduje krzepnięcie osocza

- fermentacja mannitoluh

- Clumping Factor

- paski Api

LEKOWRAZLIWOŚĆ:

Antybiogram: metoda dyfuzyjno -krażkowa

Oporne na większośc antybiotyków β- laktamowych

Stosuje się:

- cefalosporyny I generacji

17. HBV

MATERIAŁ:

Popłuczyny- zbuforowany płyn fizjologiczny PBS. Materiał przechowuje się w płynie zawierającym antybiotyki (oprócz materiałów jałowych płyn m-r i krew)

Przed posiewem:

- kału- antybiotyki żeby zniszczyć florę fizjologiczną i zamrażamy i odmrażamy kilka razy, żeby zniszczyć substancje cytotoksyczne.

HODOWLA:

Na hodowlach komórkowych w płynie Parkera (podobny w składzie do surowicy ludzkiej)

W hodowlach komórkowych szuka się zmian cytopatycznych CPE, które są charakterystyczne dla dlanych wirusów

18. Streptococcus pyogenes

ASO, odczyn antystreptolizynowy- określenie poziomu antystreptolizyny O, miano powyżej 200 świadczy o chorobie

19 Streptococcos pyogenes

MATERAIŁ:

Wymaz z gardła i nosa, ropa, krew, płyny wysiekowe, punktaty z nacieków, płyn m-r, mocz, plwocina

PREPARAT:

Nie robimy ze względu na stale obecne paciorkowce należąće do flory fizjologicznej (paciorkowce zieleniejące), ale jakby to G(+) źarniaki ułożone w łańcuszki

HODOWLA

Natychmiast po pobraniu

1.Podłoże agar z krwią baranią

2. Podłoża selektywne: PIke'a, Holmesai Termita

- hamują wzrost flory towarzyszącej:

*azydek sodu, fiolet krystaliczny, kanamycyna, nystatyna

Wygląd kolonii:

- kolonie półprzezroczyste z pasmem hemolizy β

- kolonie matowe- szczepy z antygenem M - płaskie nierówne)

- kolnie błyszczące- niezjadliwe

- kolonie sluzowe- szczepy otoczkowe

IDENTYFIKACJIA:

- test z bacytracyną- na paciorkowce wysiane na agarze kładziemy krążek bibuły z bacytracyną, 18-24h, 37°C. Zahamowanie wzrostu dookoła krążka - paciorkowce gr. A

- matoda precypitacji- polisacharyd C + surowice zawierające p/ciała dla różnych grup serologicznych (A, C, G)

- metoda IF (immunofluorestencji)

LEKOWRAZLIWOŚĆ:

Antybiogram: agar z krwią 99, 9% z gr. A wrażliwych na antybiotyki β- lakatmowe

wrazliwych na większośc antybiotyków β- laktamowych

Wrażliwe na:

Penicylina

Erytromycyna

Cefalosporyny

20.Clostridium perfringens

MATERIAŁ:

Wycinek z tkanki, ropa, krew

PREPARAT:

Metoda Grama - szukamy laseczek G(+)

HODOWLA:

Ogrzewamy w łaźni wodnej w 80°C przez 20 min. I wysiewamy na:

1)Tarrozi- Wrzosek (pojawia się gaz, NH₃ + CO₂ )

2)Wilson Blair (zaczernienie, wytwarzanie H₂S)

3)Mleko ( Ścina mleko)

RÓŻNICOWANIE:

1. S-gładkie, R- szorstkie, M- śluzowe

2. okrągłe

3. -

Aby dokładniej określić drobnoustroje:

- agar z krwią + glukoza (pożywka Zeisslera) Kolonie najpierw poziomkowe, potem brązowe, szare, zielone, otoczone strefą hemolizy

- agar z tioglikanem sodu

Różnicowanie biochemiczne:

- rozkład cukrów,

- wytwarzanie hemolizy

- próba na lecytynazę, pożywki z żółtkiem jaja otoczone pierścieniem strątu

Serologia - brak

21.Candida albicans

MATERIAŁ:

Plwocina, wymazy z zgardłą i pochwy, zeskrobiny ze zmian, wysięki, skrawki skóry i paznokci.

PREPARAT:

Należy wykonać podwójne preparaty z jednego materiały

Jedne barwi się metodą Grama a drugie pod szkiełkiem nakrywkowym niebarwione.

Jeśli preparat jest z tkanek umieścic go w kropli 10% KOH i lekko ogrzać.

W preparacie obecne są owalne kom. pączkujących drożdży i pseudomycelium.

HODOWLA:

Każdy materiał należy wysiac na dwie pożywki Sabouraud.

Jedną pozostawia się w temp. pokojowej(wzrost po 4- 5 dniach), drugą umieszcza się w 37°C (wzrost po 1- 2 dniach)

IDENTYFIKACJA:

Eykonuje się tzw test filamentacji (małe inoculum grzyba wysiewa się na surowicę ludzką i inkubuje przez 2 - 3 godz. Na surowicę ludzką. Wykonuje się preparat wilgotny i ogląda się w mikroskopie- formy plemnikopodobne.)

LEKOWRAZLIWOŚĆ:

- środki chemiczne (r-r boraksu z gliceryną)

- antybiotyki (nystatyna)

29. Pseudomonas aeruginosa

materiał-plwocina- odkrztusić

-ropa

-wymaz z nosa i tylnej ściany gardła- pobrać wymazówkę

-ewentualnie bronchoaspirat pobrany podczas bronchoskopii

preparat-barwienie metodą Grama- w obrazie pałeczki G- z rzęskami

-barwienie negatywno-pozytywne dla ukazania otoczek

hodowla-agar z krwią- kolonie dzięki obecności otoczek mają wygląd śluzowaty, są połyskliwe, okrągłe, o równych brzegach i średnicy 3-6 mm, charakterystyczny zapach miodu lub jaśminu

-podłoże MacConkeya- zawiera laktozę, sole żółci, fiolet krystaliczny; P. aeruginosa nie fermentuje laktozy, podłoże pozostaje żółte

-PPA- podłoże do wykrywania piocyjaniny produkowanej przez P. aeruginosa, barwnik ten zabarwia podłoże na kolor od jasnozielonego do ciemnoniebieskiego

identyfikacja w szlaku biochemicznym:

- woda peptonowa (na rozkład tryptofanu) -

- Christiansen (na ureazę) - (kolor żółty)

- Kliger (na rozkład glukozy i H
S) - (kolor czerwony)

- laktoza - (fioletowy)

- glukoza - (morski)

- fenyloalanina - (żółty)

- Simmons (z cytrynianem) - (zielony)

lekowrażliwość

P. aeruginosa jest oporny na wiele antybiotyków, wykonać antybiogram metodą dyfuzyjno-krążkową, ewentualnie metodą seryjnych rozcieńczeń

serologia

? (chyba nie)

30. Aspergillus sp.

materiał- plwocina- (odkrztusić); homogenizacja materiału mechaniczna lub enzymatyczna przez 45 min w temp. 37ºC

• aspirat z płuc, chirurgiczne pobranie wycinka

preparat-barwiony metodą Grama- widać strzępki rozgałęziające się pod kątem 45º

posiew-podłoże Sabourauda (agar cukrowy), pH=5,6 z chloramfenikolem hamującym wzrost bakterii; jedną hodowlę inkubować w temp. pokojowej przez 4-5 dni, drugą w temp. 37ºC przez 1-2 dni;

kolonie są duże, matowe, szare (A. fumigatus) lub czarne (A. niger)

antybiogram- metodą dyfuzyjno- krążkową

reagują zwykle na leczenie amfoterycyną B

31. Candida albicans

materiał- wymaz ze zmian na błonie śluzowej

preparat- barwienie metodą Grama

widoczne są Gram-dodatnie komórki, obecne formy pączkujące

hodowla-podłoże Sabourauda: jedna hodowla w temp. pokojowej przez 4-5 dni, druga- w temp. 37ºC przez 1-2 dni

kolonie są duże, matowe, kremowo-szare, okrągłe; drożdżaki chorobotwórcze rosną w temp. 37ºC, w pokojowej nie rosną;

identyfikacja-test filamentacji- do surowicy ludzkiej dodać ezą część kolonii Candida, inkubować przez 2-3 godz. w temp. 37ºC, potem wykonać preparat niebarwiony; w mikroskopie widać formy plemnikopodobne (jeśli to C. albicans)

-wytwarzanie chlamydospor- hodowla na podłożu Nickersona-Mańkowskiego (agarowe podłoże z proliną, witaminą B
, Tween 80; po 24-48 godzinach inkubacji widać chlamydospory wewnątrz strzępki, na szczycie lub z boku

-auksonografia- do wykazania asymilacji cukrów i związków azotowych; do podłoża Sabourauda dodać zawiesinę Candida, wymieszać, wylać do płytki Petriego; po skrzepnięciu podłoża nałożyć krążki bibuły nasycone węglowodanami i związkami azotowymi; inkubować w temp. 37ºC; związki dyfundują do podłoża a wokół nich widać intensywniejszy wzrost Candida

-fermentacja cukrów metodą Durhama- szereg cukrów z rurką Durhama i wskaźnikiem błękitem bromokrezolowym

antybiogram- metoda dyfuzyjno-krążkowa

zakażenia drożdżakowe leczy się flukonazolem

diagnostyka serologiczna-wykazanie przeciwciał klasy IgM dla antygenów polisacharydowych metodą hemaglutynacji pośredniej

-wykazanie przeciwciał klasy IgG wobec antygenów polisacharydowych metodą immunofluorescencji pośredniej lub metodą immunoenzymatyczną

-wykrycie przeciwciał dla antygenów białkowych odczynem precypitacji

32. Escherichia coli (szczepy nefropatogenne)

materiał-mocz- pobrany metodą środkowego strumienia ewentualnie poprzez nakłucie nadłonowe (w przypadku gdy dziecko nie chce współpracować)

-krew na badanie poziomu przeciwciał

preparat-barwienie metodą Grama- w mikroskopie widoczne są Gram-ujemne pałeczki

hodowla-agar z krwią- kolonie są okrągłe, o gładkiej powierzchni, średnicy 3-6 mm, równych brzegach

-podłoże MacConkeya z laktozą, solami żółci i fioletem krystalicznym- E. coli fermentuje laktozę, kolonie stają się różowe;

-oprócz posiewu jakościowego (dla określenia bakterii) wykonuje się też posiew ilościowy dla określenia ilości bakterii w 1 ml moczu

znamienna bakteriuria dla Enterobacteriaceae- 10
komórek w 1 ml

identyfikacja w szeregu biochemicznym:

- woda peptonowa (z czerwienią metylową) + (czerwony pierścień na dnie probówki)

- Christiansen - (kolor żółty)

- Kliger +

- laktoza + (żółty)

- glukoza + (żółty z pomarańczowym osadem)

- fenyloalanina - (żółty)

- Simmons - (zielony)

można też określić typ serologiczny za pomocą wzorcowych surowic odpornoścoiwych

lekowrażliwość- metoda dyfuzyjno-krążkowa

E. coli oporna jest na antybiotyki β-laktamowe, niektóre szczepy są wrażliwe na karbapenemy

Określenie miana przeciwciał- metodą hemaglutynacji biernej

33. Proteus vulgaris

materiał-mocz pobrany metodą środkowego strumienia lub przez nakłucie nadłonowe

preparat-barwienie metodą Grama- w mikroskopie widać Gram-ujemne pałeczki, obecne rzęski

-w preparacie bezpośrednim widać bardzo ruchliwe pałeczki

hodowla-agar zwykły lub agar z krwią- kolonie są okrągłe, szarawe, mają tendencję do rozpełzania się po płytce

-podłoże MacConkeya- Proteus nie rozkłada laktozy, podłoże pozostaje żółte

-podłoże SS- kolonie są szarawe z czarnymi środkami

identyfikacja w szeregu biochemicznym:

- woda peptonowa + (chyba)

- Chriastiansen (na ureazę) + (różowy)

podłoże zawiera mocznik i wskaźnik pH (czerwień krezolowa)

mocznik
NH
+ CO

wydzielający się w reakcji amoniak podnosi pH, wskaźnik zmienia barwę na różową

- Kliger + (widać czarny strąt siarczku żelaza)

- glukoza - (morski)

- laktoza -

- fenyloalanina + (na dole probówki szaro-zielony pierścień)

- Simmons -

lekowrażliwość- metoda dyfuzyjno-krążkowa

jest oporny na szereg podstawowych antybiotyków, choć w szczegółach, trudno powiedzieć

34. Streptococcus agalactiae

materiał-płyn mózgowo-rdzeniowy pobrany przez nakłucie lędźwiowe, część płynu przeznaczona jest do badania ogólnego, część do badania bakteriologicznego; posiew można wykonać już przy łóżku pacjenta na odpowiednie podłoże transportowe; nie wolno dopuścić do schłodzenia próbki poniżej 30ºC

-oprócz tego pobiera się wymaz z gardła, nosa, plwocinę, krew

preparat-barwienie metodą Grama

widać Gram-dodatnie ziarenkowce układające się w łańcuszki

hodowla-agar z krwią

widać kolonie o średnicy 1 mm, płaskie, o równych brzegach, barwy kremowej, otoczone wąską strefą hemolizy typu β

identyfikacja-próba z bacytracyną ujemna

-test CAMP (test synergistycznej hemolizy)- zewnątrzkomórkowe białko wytwarzane przez paciorkowce grupy B powoduje wzrost aktywności β-hemolitycznej Staphylococcus aureus

-test aglutynacji lateksowej- daje szybki wynik

lekowrażliwość- metoda dyfuzyjno-krążkowa wykonana na podłożu z krwią

są wrażliwe na penicylinę???

35. Chlamydia trachomatis

materiał-wydzielina z cewki moczowej (nie stosować wymazówek z alginianem wapnia bo działają toksycznie na chlamydie)

-krew na oznaczanie przeciwciał

preparat-metodą Grama się nie barwią

-metoda Giemsy- ciałka podstawne barwi na czerwono a ciałka wtrętowe na niebiesko

-barwienie jodyną Jonesa (jod + jodek potasu rozpuszczone w alkoholu metylowym) ciałka wtrętowe barwią się na kolor brunatnoczerwony ze względu na obecność glikogenu (swoiste dla Ch. trachomatis)

hodowla- nie rosną na podłożach sztucznych tylko na hodowlach komórkowych (zarodki ptasie lub mysie fibroblasty); jest to metoda czasochłonna, kosztowna i nie zawsze dostępna, dlatego rzadko stosowana;

identyfikacja-metody serologiczne:

- immunofluorescencja bezpośrednia- przeciwciała znaczone fluorochromem reagują z ciałkami elementarnymi

- testy immunoenzymatyczne- wykrycie antygenu LPS w próbkach z cewki

- hybrydyzacja DNA i technika PCR

- odczyn wiązania dopełniacza

oznaczanie miana przeciwciał metodą hemaglutynacji biernej

49. Streptococcus agalactiae

materiał-płyn mózgowo-rdzeniowy pobrany podczas nakłucia lędźwiowego; część próbki przeznaczona jest do badania ogólnego, część do badania bakteriologicznego; posiewu można dokonać bezpośrednio przy łóżku pacjenta na podłoże Meningomedium; nie dopuścić do schłodzenia próbki poniżej 30ºC

-można też pobrać wymaz z gardła, krew

preparat-barwienie metodą Grama- widoczne są Gram-dodatnie ziarenkowce układające się w łańcuszki

hodowla-agar z krwią- widać kolonie o średnicy 1 mm, płaskie, o równych brzegach, barwy kremowej otoczone strefą hemolizy typu β

identyfikacja

- próba z bacytracyną ujemna

- test CAMP (test synergistycznej hemolizy)- wzrost aktywności β-hemolitycznej Staphylococcus aureus pod wpływem zewnątrzkomórkowego białka wytwarzanego przez paciorkowce z grupy B

- test aglutynacji lateksowej- daje szybki wynik

lekowrażliwość- określana metodą dyfuzyjno-krążkową na podłożu z krwią

wrażliwe na penicylinę??

50. bakteriemia, najprawdopodobniej po zakażeniu E. coli

materiał-krew- najlepiej pobrać 3 próbki o objętości 10-30 ml w ciągu 24 h do dwóch butelek zawierających podłoża płynne- jedną inkubować w warunkach beztlenowych, drugą w warunkach tlenowych (można jeszcze dodać do podłoża CO
dla bakterii mikroaerofilnych)

- dla Enterobacteriaceae najlepiej próbkę krwi wymieszać w probówce zawierającej saponinę, która powoduje lizę białych i czerwonych krwinek; zhemolizowaną krew odwirować a osad posiać na pożywki

- podłoża hodowlane: najczęściej stosuje się podłoże tryptozowe, tryptozowo-sojowe, bulion mózgowo-sercowy; w większości z nich znajduje się polinetosulfonian sodu który hamuje krzepnięcie krwi

- z hodowli, w której stwierdza się wzrost, wykonać preparat barwiony metodą Grama

- dalsze postępowanie jak przy identyfikacji podejrzewanej bakterii (dla E. coli, patrz pytanie 32, wszystko poza materiałem powinno się zgadzać)

51. Aspergillus sp.

materiał-plwocina- odkrztusić; materiał poddać homogenizacji mechanicznej lub enzymatycznej przez 45 min w temp. 37ºC

-ewentualnie aspirat z płuc, chirurgiczne pobranie wycinka

preparat-barwiony metodą Grama- widać strzępki rozgałeziające się pod kątem 45º

posiew-na podłoże Sabourauda (agar cukrowy), ph=5,6 z chloramfenikolem hamującym wzrost bakterii; jedną hodowlę inkubować w temp. pokojowej przez 4-5 dni, drugą w temp.37ºC przez 1-2 dni;

kolonie są duże, matowe, szare (A. fumigatus) lub czarne (A. niger)

antybiogram- metoda dyfuzyjno-krążkowa

reagują na leczenie amfoterycyną B

52. Bakteriemia

Prawie wszystkie uwagi dotyczące materiału z pytania 50. są aktualne, poza powodowaniem hemolizy krwi (ta metoda tylko dla Enterobacteriaceae, ewentualnie jeszcze dla Staphylococcus).

53. Vibrio cholerae

materiał-kał pobrany w ciągu pierwszych dwóch dni choroby

preparat-świeży- w mikroskopie widoczne bardzo ruchliwe bakterie

-barwiony metodą Grama- widać Gram-ujemne przecinkowce

hodowla-podłoże agarowe z 5% krwi baraniej i 1% NaCl- rosną szaro-białe kolonie z hemolizą α lub β

-woda peptonowa, zasadowa (pH=8,4-8,6) z NaCl

-podłoże TCBS (thiosulfate-citrate-bile-sucrose) z tiosiarczanem, cytrynianem, żółcią, sacharozą, pH=8,6 (Vibrio lubi podłoża zasadowe)- pomaga zróżnicować z jakim gatunkiem mamy do czynienia

identyfikacja-próba nitrozoindolowa- dodać kwas siarkowy do hodowli w wodzie peptonowej
powstaje czerwone zabarwienie

-aglutynacja szkiełkowa z surowicą anty-01 pozwala na szybką identyfikację

lekowrażliwość- metoda dyfuzyjno-krążkowa

V. cholerae dobrze reaguje na chloramfenikol i tetracykliny, chociaż terapia antybiotykami zarezerwowana jest dla ciężkich przypadków

określenie miana przeciwciał- odczyn aglutynacji

choroba ma ostry przebieg, przeciwciała pojawiają się zwykle w okresie rekonwalescencji; miano jest niskie, przeciwciała utrzymują się w organizmie kilka miesięcy

54. biegunka podróżnych- Escherichia coli

materiał-kał pobrany na początku choroby

dalsze postępowanie w pyt. 32

lekowrażliwość- metoda dyfuzyjno-krążkowa

zasadniczo antybiotyki powinny być stosowane tylko w ciężkich przypadkach, właściwe postępowanie terapeutyczne to nawadnianie, wyrównanie niedoboru zasad i elektrolitów etc.

55. Cryptococcus neoformans

Badanie płynu m-r: odczyn aglutynacji lateksu

Badanie histologiczne: barwienie hematoksyliną i eozyną, lub metoda Gomoriego (GMS)

Mucykarmin - barwi otoczkę polisacharydową na kolor jasnoczerwony

Immunofluorescencja bezpośrednia

Badanie serologiczne: immunofluorescencja pośrednia

Materiał: płyn m-r, mocz, lub materiał z biopsji tkankowej

Hodowla: kolonie są kremowe lub białe, mają śluzowy wygląd

Leczenie: skojarzenie amfoterycyny B z 5-fluorocytozyną (5-FC)

Zapobieganie nawrotom - flutikonazol

56. Bacillus anthracis

Materiał: ropa, plwocina, kał, krew

Preparat: barwienie metodą Grama lub błękitem Lofflera - stwierdza się duże G+ laseczki zwykle ułożone w krótkie łańcuchy znajdujące się we wspólnej otoczce.

Hodowla: Jednocześnie z preparatu wykonuje się posiew na agar zwykły, agar z krwią. Na agarze wypadają charakterystyczne szare kolonie z białym nalotem i licznymi wypustkami (caput Medusae)

W preparacie z hodowli stwierdza się ułożone w długie łańcuchy laseczki, w których już po 48h pojawiają się centralnie ułożone zarodniki

Próba biologiczna: zakażenie białej myszki, lub świnki morskiej bezpośrednim preparatem od chorego a po 24-72 h zwierzaki padają i z krwi zwierzęcia można wychodować zarazki.

W tkankach zwierzęcych można wykryć antygeny Bacillus anthracis za pomocą odczynu termoprecypitacji Ascoliego

Leczenie: penicylina, czasem stosuje się preparaty arsenowe

W ciężkich przypadkach podaje się surowicę przeciwwąglikową

57. Legionella pneumophila

Badanie mikroskopowe: szybka diagnostyka polega na wysrebrzaniu, lub immunofluorescencji bezpośredniej bioptatu tkanki, lub plwociny za pomocą przeciwciał przeciwko Legionella znakowanych fluoresceiną

Hodowla: najlepszym podłożem jest agar zawierający wyciąg z drożdży z węglem aktywowanym zbuforowanym do pH 6 i uzupełniony cysteiną.Do wzrostu potrzebuje zwiększonego [CO2] i zwiększonej wilgotności

Serologia: trzeba czekać 2-3 tygodnie na wyniki więc lipa a jakby nie patrzeć leczenie trzeba zacząć wcześniej.

Miano przeciwciał wynoszące 256, lub więcej w ostrej fazie choroby wskazuje na zakażenie

Leczenie: antybiotyki makrolidowe (erytromycyna, klarytromycyna, arytromycyna)

Także doksycyklina

58. Chlamydia psittaci

Materiał: krew, popłuczyny z gardła, plwocina, ewentualnie wymiociny

W rozmazach po zabarwieniu metodą Giemzy, lub Macchiavella widać liczne ciałka elementarne wewnątrz cytoplazmy. Dokładne określenie gatunku polega na przeprowadzeniu badań biologicznych i wykonaniu odczynu immunofluorescencyjnego, względnie odczyn zobojętniania surowicą swoistą

Duże znaczenie w rozpoznaniu papuzicy ma OWD. Wykonuje się go z dwoma antygenami - właściwym i kontrolnym. Znaczenie diagnostyczne mają miana od 1:16 wzwyż

OWD - odczyn wiązania dopełniacza

Można jeszcze wykonać odczyn zahamowania hemaglutynacji i mikroaglutynacji

Leczenie: tetracykliny

59. Wirus HAV

Stwierdzenie p/ciał anty-HAV klasy IgM świadczy o obecnym, lub niedawno przebytym zakażeniu, a wykrycie p/ciał anty-HAV klasy IgG(bez IgM) oznacza dawno przebytą ekspozycję na wirus

Leczenie: jest objawowe. Preparaty ludzkiej gamma-globuliny zawierające p/ciała anty-HAV ppodane zaraz po kontakcie z wirusem mogą zapobiec chorobie, lub złagodzić objawy

60. Borrelia burgdorferi

Barwienie: rozmaz krwi obwodowej, lub osad płynu m-r barwiony:

1. oranżem akrydynowym

2. swoistymi p/ciałami fluoryzującymi

3. metodą Giemsy

Można je też uwidocznić (bakterie) w tkankach barwionych metodą wysrebrzania

Hodowla: na podłożach płynnych z próbek pobieranych z brzegu zmiany, krwi, lub płynu m-r

Testy serologiczne:

1. Metoda western blot - czyli tutaj wykrywanie p/ciał przeciwko białku 39kDa (typowe dla Borrelia b.)

2. Łańcuchowa reakcja polimeryzacji PCR

Leczenie: wczesne stadium choroby doksycyklina, amoksycyklina, erytromycyna

Późne stadium: ceftiakson

---