AMINOKWASY

Są podstawowymi elementami budulcowymi białek. Alfa-aminokwas jest zbudowany z centralnie usytuowanego atomu węgla, określanego jako węgiel alfa, połączonego z grupą aminową, karboksylową, atomem wodoru i łańcuchem bocznym (grupa R). Cztery różne grupy połączone z tetraedrycznym atomem węgla nadają charakter chiralny, powstają dwa izomery L i D. Białka zbudowane są wyłącznie z L-aminokwasów.

Alifatyczne: Glicyna (GLY, G), Alanina (ALA,A), Walina(VAL,V), Leucyna (LEU,L), Izoleucyna (ILE, I) , Prolina (PRO,P)

Aromatyczne (mają pierścień aromatyczny): Fenyloalanina (PHE,F), Tyrozyna (TYR,Y), Tryptofan (TRP, W)

Hydroksyaminokwasy (zawierają grupę -OH): Seryna (SER,S), Treonina (THR,T)

Siarkowe: Cysteina (CYS,C), Metionina (MET,M)

Zasadowe: Lizyna (LYS,K), Argninina (ARG,R), Histydyna (HIS,H)

Kwaśne i ich amidy: Kwas glutaminowy(GLU,E), Kwas asparaginowy (ASP,D), Glutamininan (GLN,Q), Asparaginian (ASN,N)

RNA różni się od DNA tym, że:

• jest przeważnie cząsteczką jednoniciową

• często zasady parują się miedzy sobą (wewnątrzniciowe parowanie zasad)

• wykorzystuje uracyl zamiast tyminy

BUDOWA DNA:

DNA jest liniowym polimerem, w którego skład wchodzą cztery monomery, posiada stały rdzeń zbudowany z powtarzających się jednostek cukrowo-fosforanowych. Cukier do deoksyryboza, do każdego cukru dołączona jest jedna z czterech zasad: adenina, cytozyna, guanina, tymina. Wszystkie cztery zasady są płaskie, puryny to adenina, guanina, natomiast pirymidyny to cytozyna, tymina (w RNA uracyl). DNA jest przestrzenną strukturą o nazwie dwuniciowa helisa, ułożona tak, że cukrowo-fosforanowy rdzeń leży na zewnątrz, a zasady znajdują się we wnętrzu helisy. Adenina tworzy podwójne wiązanie z tyminą, guanina potrójne wiązanie z cytozyną. Każda para zasad ma taki sam kształt dlatego pasuje do wnętrza helisy. Sekwencja wzdłuż jednej nici determinuje całkowicie sekwencję drugiej nici.

BUDOWA RNA:

Cukrem zamiast deoksyrybozy jest ryboza, a zamiast tyminy występuje uracyl. RNA Pełni trzy funkcje:

• pośredniczy w przepływie informacji z DNA do białka. DNA jest transkrybowany na informacyjny RNA (mRNA), który ulega translacji w procesie syntezy białka.

• Pełni funkcje adaptorów, które przetwarzają informację zawartą w sekwencji kwasu nukleinowego mRNA w informację określająca sekwencję składników budujących białko

• są ważnymi składnikami rybosomów, które prowadzą translację.

WIĄZANIA ELEKTROSTATYCZNE (JONOWE):

Zależą od elektrycznych ładunków atomów. Wiązanie to powstaje najczęściej między metalem a niemetalem. Różnica elektroujemności w skali Paulinga jest większa lub równa 1,7. Największy udział tego rodzaju wiązania można zaobserwować w związkach Litowców z fluorowcami.  Związki, w których ono występuje, są zdolne do dysocjacji elektrolitycznej, tzn. do rozpadu na wolne jony. Stopy i roztwory związków chemicznych, w których występuje wiązanie jonowe są elektrolitami, tzn. są zdolne do przewodzenia prądu elektrycznego. Jest nazywane mostkiem solnym. Angażuje tylko cząsteczki posiadające ładunek. Jest osłabiane w wodzie. Przeważnie posiada energię między 3 a 7 kcal/mol.

WIĄZANIA WODOROWE:

Angażuje atomy O i H lub N i H. Jest osłabiane w wodzie. Wymaga cząsteczek polarnych lub z ładunkiem. Są stosunkowo słabymi wiązaniami, występuje w budowie DNA i białek. Są w zasadzie wiązaniami elektrostatycznymi. Są znacznie słabsze od wiązań kowalencyjnych. Najsilniesze wiązania wodorowe to te którego donor, atom wodoru i akceptor lezą w jednej linii (są kolinearne). Przeważnie posiada energię między 3 a 7 kcal/mol.

WIĄZANIA VAN DER WAALSA:

Są to oddziaływania między trwałym dipolem i indukowanym (wzbudzonym) dipolem. Są spowodowane zachodzącymi w czasie zmianami rozkładu ładunków elektronowych wokół atomu. Posiada energię około 1 kJ/mol. Jest optymalne dla odległości kontaktowej van der Waalsa. Angażuje atomy polaryzowane.

ODDZIAŁYWANIA HYDROFOBOWE:

Istnieje tylko w wodzie. Wymaga cząsteczek niepolarnych. Oddziaływanie to odpycha cząsteki wody. Występuje w białkach w strukturach 3 i 4-rzędowych.

BIAŁKA:

Są liniowymi polimerami, zbudowanymi z monomerycznych jednostek, zwanych aminokwasami. Zwijają się spontanicznie w struktury przestrzenne. Białka zawierają szeroki zakres grup funkcyjnych, powoduje to duże zastosowanie białek: - pełnią funkcje strukturalne (budulec struktur komórkowych: błon i koloidów komórkowych, chromatyny, składnik tkanek łącznych, wytworów naskórka kręgowców, płynów ustrojowych);
- jako enzymy biorą udział w katalizie enzymatycznej;
- transportują i magazynują substancje (np. hemoglobina, ferrytyna);
- umożliwiają ruch (białka motoryczne: miozyna, dyneina);
- uczestniczą w sygnalizacji (hormony białkowe, czynniki wzrostu);
- biorą udział w regulacji genów;
- stanowią ochronę immunologiczną organizmu (immunoglobuliny);
- pełnią funkcje receptorowe (np. rodopsyna);
- są materiałem zapasowym (np. w jajach, nasionach niektórych roślin);
- mogą stanowić źródło energii (po deaminacji aminokwasów produkty ich rozkładu włączane są do cyklu Krebsa).

Ze względu na skalę przestrzenną pełną strukturę białka można opisać na czterech poziomach:

• Struktura pierwszorzędowa białka (sekwencja aminokwasów, struktura pierwotna białka) - kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym

• Struktura drugorzędowa białka - przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów polipeptydowych. Do struktur drugorzędowych zaliczana jest:

• helisa alfa (ang. α helix)

• harmonijka beta (ang. β sheet)

• beta zakręt (pętle omega) (ang. β hairpin)

• Struktura trzeciorzędowa białka - wzajemne położenie elementów struktury drugorzędowej.

• Struktura czwartorzędowa białka - wzajemne położenie łańcuchów polipeptydowych oraz ewentualnie struktur niebiałkowych (grupa prostetyczna):

• cukrów w glikoproteidach

• lipidów w lipoproteidach

• kwasów nukleinowych w nukleoproteidach

• barwników w chromoproteidach

• resztę kwasu fosforowego w fosfoproteidach.

WIĄZANIE PEPTYDOWE:Nie ma rotacji, jest płaskie, ma częściowo charakter wiązania podwójnego ( wiązanie pomiędzy węglem karbonylowym a azotem). Wodór związany z azotem w stosunku do tlenu grupy karboksylowej jest w konfiguracji trans.

Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzy oligopeptydy (umownie, do 10 reszt aminokwasowych), polipeptydy (do 100 reszt) oraz białka (powyżej 100 reszt). Wiele aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi tworzy łańcuch polipeptydowy. Jednostkę aminokwasu wbudowaną w ten łańcuch nazywamy resztą aminokwasową. Łańcuch polipeptydowy jest spolaryzowany, ponieważ ma dwa różne końce- na jednym końcu znajduje się grupa alfa-aminowa na drugim alfa-karboksylowa. Jako początek łańcucha umownie przyjęto jego koniec aminowy. Łańcuch polipeptydowy jest złożony z powtarzających się regularnie części tworzących łańcuch główny ( szkielet) oraz z charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów. Szkielet polipeptydowy ma bogaty potencjał wiązań wodorowych. Każda reszta ma grupę karbonylową, która jest dobrym akceptorem wiązania wodorowego, z wyjatkiem proliny, której grupa NH jest dobrym donorem wiązania wodorowego. Przeciętna masa cząsteczkowa reszty aminokwasowej wynosi około 110 daltonów.

W niektórych białkach liniowe łańcuchy polipeptydowe są połączone wiązaniami poprzecznymi. Najczęściej występującym wiązaniem poprzecznym jest mostek disiarczkowy (wiązanie kowalencyjne!), który tworzy się w wyniku reakcji utleniania pary reszty cysteiny. Białka wewnątrzkomórkowe na ogół nie zawierają mostków disulfidowych, natomiast wewnątrzkomórkowe często zawierają ich kilka.

CZYNNIKI DENATURUJĄCE BIAŁKO:

• mocznik ( niszczy wiązania wodorowe, elektrostatyczne)

• temperatura ( niszczy wiązania wodorowe, zwiększa się energia kinetyczna)

• kwas ( jony H+ konkurują i rozbijają połączenia)

• chlorowodorek guanidyny ( działa na tej samej zasadzie co kwas)

• SDS (niszczy wszystkie wiązania)

• beta-merkaptoetanol ( niszczy mostki disiarczkowe)

• alkohol

• metale ciężkie

ZWIJANIE SIĘ BIAŁEK:

Zwijanie się białka i jego rozplatanie jest procesem opartym na zasadzie "wszystko albo nic", wynikającym z faktu, że to przejście ma charakter kooperatywny. Gdy dojdzie do uszkodzenia fragmentu zwiniętej struktury, znikną oddziaływania. Brak oddziaływań destabilizuje strukturę pozostałej części białka. Takie warunki prowadzące do uszkodzenia jakiejkolwiek części białka mogą spowodować jego całkowite rozplecenie. Konsekwencji kooperatywnego zwijania białek można zilustrować analizując białko które powinno być w połowie zwinięte. W rzeczywistości będzie 50% cząsteczek całkowicie zwiniętych i 50% całkowicie rozwiniętych. Kooperatywne zwijanie się chroni przed akumulacją struktur częściowo zwiniętych, które mogą prowadzić do zaburzeń w procesie komórkowym. Białko poszukując konformacji najbardziej stabilnej, przybiera wszystkie możliwe konformacje. Istotą zwijania się białka jest zachowanie częściowo poprawnych półproduktów. Kryterium poprawności nie polega na analizie konformacji każej kolejnej reszty aminokwasowej lecz staniowi je poziom całkowitej energii swobodnej stanu przejściowego. Białka są stabilne tylko w niewielkim stopniu. Jednakże oddziaływania prowadzące do kooperatywnego zwijania mogą stabilizować produkty pośrednie powstające w trakcie formowania się ostatecznej struktury. Lokalne regiony wykazują znaczną preferencję do tworzenia struktur, niekoniecznie stabilnych indywidualnie, będą miały tendencje do tworzenia struktur optymalnych, a po ich utworzeniu mogą wchodzić w oddziaływania z innymi strukturami, co w efekcie zwiększy całkowitą stabilizację.

WYSALANIE:

Rozpuszczalność większości białek zmniejsza się w stężonych roztworach soli. Efekt ten nazywamy wysalaniem. Białka różnią się rozpuszczalnością w stężonych roztworach soli, dlatego wysalanie można wykorzystać do ich frakcjonowania. Np. Fibrynogen wytrąca się w 0,8M roztworze siarczanu amonu a albumina w 2,4M. Wysalanie stosuje się również do zagęszczania rozcieńczonych roztworów białek, w tym frakcji aktywnych uzyskanych na różnych etapach oczyszczania.

DIALIZA: Białka można oddzielić od małych cząsteczek metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną, taką jak porowata błona celulozowa. Cząsteczki o wymiarach większych niż średnica pora pozostają w woreczku dializacyjnym, natomiast mniejsze cząsteczki oraz jony przechodzą przez pory błony i pojawiają się w dializacie, na zewnątrz woreczka. Ta technika przydatna jest do usuwania soli i małych cząsteczek, ale nie nadaję się do frakcjonowania białka.

CHROMATOGRAFIA METODĄ FILTRACJI ŻELOWEJ:

Cząsteczki różniące się wielkością można lepiej rozdzielić metodą filtracji żelowej. Próbkę nakłada się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną porowatymi ziarenkami, zbudowanymi z nierozpuszczalnego, lecz silnie uwodnionego polimeru typu dekstran, czy agaroza (oba te wypełniacze są węglowodanami) lub poliakryloamid. Małe cząsteczki wnikają do wnętrza tych ziaren, duże nie mogą. W rezultacie małe cząsteczki pozostają rozproszone w roztworze wodnym, znajdującym się w ziarnach żelu oraz pomiędzy nimi, a duże cząsteczki znajdują się tylko w roztworze wodnym wypełniającym przestrzennie pomiędzy ziarnami żelu. Objętość kolumny dostępna dla dużych cząsteczek jest zatem zmniejsza niż dla małych cząsteczek, dlatego duże cząsteczki przepływają przez kolumnę szybciej i jako pierwsze pojawiają się u wylotu kolumny.(Duże białka wypływają wcześniej od małych ponieważ nie mogą wniknąć do wnętrza ziaren żelu).

CHROMATOGRAFIA JONOWYMIENNA:

Rozdział białek można również przeprowadzić metodą chromatografii jonowymiennej korzystając z różnic w ładunku wypadkowym odmiennych cząstek białkowych. Białka o małej gęstości ładunków wypadkowych dodatnich będą zatem wypływały z kolumny jako pierwsze, a białka o większej gęstości ładunków później. Białka naładowane dodatnio można rozdzielać na kolumnie z ujemnie naładowaną CM-celulozą. Białka naładowane ujemnie można rozdzielać na kolumnach wypełnionych dodatnio naładowaną DEAE-celulozą.

CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA:

W technice tej wykorzystuje się powinowactwo wielu białek do specyficznych grup chemicznych. Chromatografia powinowactwa może być skutecznie stosowana do izolacji czynników transkrypcyjnych i białek regulująch ekspresję genów poprzez zdolność wiązania się tych białek ze specyficznymi sekwencjami DNA. Wówczas mieszaninę białka przesącza się przez kolumnę wypełnioną nośnikiem, do którego zostały przyłączone specyficzne sekwencje DNA. Białka wykazujące powinowactwo do tych sekwencji będą zatrzymywane na kolumnie. W tym przypadku czynnik transkrypcyjny jest uwalniany przez przemycie kolumny roztworem o dużym stężeniu soli. Ogólnie chromatografia powinowactwa może być skutecznie stosowana do izolowania białek rozpoznających grupę X.

WYSOKOCIŚNIENIOWA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC):

Jest ulepszoną wersją metod kolumnowych, wcześniej omówionych. Materiały wypełniające kolumnę są znacznie bardziej rozdrobnione, zawierają więcej miejsc oddziaływań, zatem mają większą zdolność rozdzielczą. Ponieważ kolumna jest wypełniona drobniejszym nośnikiem do uzyskania większej prędkości przepływu konieczne jest zastosowanie zwiększonego ciśnienia, uzyskujemy wysoką rozdzielczość i szybki rozdział.

ELEKTROFOREZA ŻELOWA (SDS-PAGE):

Wykorzystane jest zjawisko posiadania ładunków przez cząsteczkę i poruszania się jej w polu elektrycznym. Szybkość wędrówki v białka w polu zależy od natężenia pola elektrycznego E, do wypadkowego ładunku cząsteczki białka z i współczynnika tarcia f. Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze w żelu (lub na stałym nośniku), przez co znacznie zwiększają rozdzielczość. Cząsteczki o małych rozmiarach poruszają się z dużą prędkością, cząsteczki większe prawie się nie poruszają. Pośrednie poruszają się w żelu z różną prędkością. Elektroforezę prowadzi się na cienkich, pionowo ustawionych płytach z żelem poliakryloamidowym. Kierunek elektroforezy przebiega od góry do dołu. Białka można łatwo rozdzielić na podstawie różnic w ich masach cząsteczkowych stosując elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących. Mieszaninę białek rozpuszcza się w roztworze SDS, który niszczy niemal wszystkie oddziaływania niekowalencyjne w natywnych białkach. Merkaptoetanol redukuje natomiast mostki disiarczkowe. Kompleksy SDS ze zdenaturowanym białkiem poddaje się następnie elektroforezie. Po jej zakończeniu białka wybarwia się srebrem lub barwnikiem, pojawia się seria prążków. Małe białka poruszają się w żelu szybko, natomiast duże zatrzymują się na górze, blisko miejsca nałożenia mieszaniny na żel. Jest to metoda szybka, czuła i o bardzo dużej rozdzielczości. Elektroforezę SDS-PAGE stosujemy do sprawdzenia wydajności stosowanej procedury izolacji, poddając rozdziałowi każdą frakcję z poszczególnych etapów oczyszczania.

OGNISKOWANIE IZOELEKTRYCZNE:

Białka można rozdzielić elektroforetycznie wykorzystując ich względną zawartość reszt kwasowych i zasadowych. Podczas rozdzielania wykorzystuje się punkt izoelektryczny białka. Każde białko ma swój punkt izoelektryczny ( takie pH przy którym wypadkowy ładunek białka jest równy zeru). Białko po dotarciu do swojego punktu izoelektrycznego zatrzymuje się. Można rozdzielić już białka różniące się pI zaledwie o 0,01.

ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA:

W celu uzyskania rozdziału z bardzo dużą rozdzielczością można połączyć technikę ogniskowania izoelektrycznego z elektroforezą SDS-PAGE. Wówczas pojedynczą próbę poddaje się najpierw izoelektrycznemu ogniskowaniu. Następnie poddaje się je ponownie elektroforezie w kierunku prostopadłym, w celu uzyskania dwuwymiarowego obrazu plam. W kierunku poziomym białka zostały rozdzielone względem ich punktu izoelektrycznego, a w kierunku pionowym- na podstawie różnic w ich masie cząsteczkowej.

SEDYMENTACJA RÓWNOWAGOWA:

Preparat białka wiruje się przy stosunkowo małych obrotach, tak aby sedymentacja została zrównoważona przez dyfuzję. Jest to metoda dokładna i można ją zastosować w warunkach nie denaturujących, w których zachowana jest natywna struktura czwartorzędowa multimeryczna białek.

SPETROSKOPIA MAS:

Umożliwia rozróżnienie białek które różnią się jednym protonem. Oznacza masę cząsteczkową białka. Białko musi być przeprowadzone w formę gazową i musi mieć ładunek. Pole elektryczne przyspiesza cząsteczki z ładunkiem i mierzy czas przelotu do detektora. MALDI ( jonizacja laserem wspomaganą matrycą) - próbkę białka poddaje się jonizacji, a następnie powstałym zjonizowanym cząsteczkom białka nadaje się przyspieszenie w polu elektrycznym, Pod jego wpływem wędrują w rurze przelotowej, przy czym najmniejsze wędrują najszybciej i docierają do detektora. Czas przelotu w rurze jest miarą stosunku masa/ładunek. Tą metodą można analizować bardzo małe ilości biocząsteczek, od kilku pikomoli do femtomoli.

MS Z UŻYCIEM ELEKTROROZPRASZANIA- z próbki tworzy się spray, rozpuszczalnik jest lotny a białko jest w stanie gazowym.

WESTERN BLOCKING:

Za pomocą elektroforezy SDS-PAGE białka przenosimy na błonę mikrocelulozową. Powstały w wyniku reakcji kompleks przeciwciało-antygen można wykryć przemywając drugim przeciwciałem, specyficznym dla pierwszego. Radioaktywne piętno drugiego przeciwciała powoduje pojawienie się ciemnego prążka na kliszy rentgenowskiej.

ELEKTROFOREZA DIAGONALNA:

Peptydy są rozdzielone przez dwuwymiarową elektroforezę w trakcie której (pomiędzy elektroforezami) peptydy zostają poddane działąniu kwasu mrówkowego. Białko jest specyficznie rozcinane w warunkach nieuszkadzających wiązań dwusiarczkowych.

NMR:

Spektorskopia magnetycznego rezonansu jądrowego-umożliwia określenie struktury trójwymiarowej białka w roztworze, ma ogarniczenie- można w ten sposób przebadać białka które są nie większe niż 18 tys. Daltonów.

KRYSTALOGRAFIA RENTEGNOWSKA:

Umożliwia określenie struktury białka w trójwymiarze, ustala przestrzenne ułożenie atomów w cząsteczce, przedtem białka trzeba wykrystalizować np za pomocą dodawania do stężonego roztworu siarczanu amonu lub innej soli, w celu zmniejszenia jego rozpuszczalności.

MIKROSKOPIA FLUORESCENCYJNA:

Fluorescecyjne markery zostały wykorzystane do bardzo wydajnego sposobu śledzenia białek w ich biologicznym środowisku. W celu zlokalizowania analizowanego białka, komórki wybarwia się za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał lub białek i obserwuje w mikroskopie fluorescencyjnym. Markery fluorescencyjne pozwalają również badać funkcję białka. Największa rozdzielczość mikroskopu fluorescencyjnego wynosi 200nm.

MIKROSKOPIA IMMUNOELEKTRONOWA:

Przeciwciała można również skonfigurować z drobinkami złota w celu uwidocznienia ich w mikroskopie elektronowym. Mikroskopia immunoelektronowa pozwala na określenie położenia antygenu z rozdzielczością poniżej 10nm.

DEGRADACJA EDMANA:

Polega na kolejnym odszczepianiu reszt aminokwasowych od końca aminowego peptydu. Fenyloizotiocyjanian reaguje z wolną grupą aminową peptydu, tworząc pochodną fenylotiokarbamoilową. Procedurę Edmana mozna przeprowadzić powtórnie dla skróconego peptydu, uzyskując pochodną PTH kolejnego aminokwasu, którą znowu można zidentyfikować chromatograficznie. Trzy następne cykle prowadzą do ujawnienia całkowitej sekwencji aminokwasowej. Stosując automatyczny sekwenator, w ktorym cykliczne degradacje Edmana są zautomatyzowane, można oznaczyć sekwencję około 50 reszt.

ELISA:

Są to testy immunoenzymatyczne. Enzym jest związany kowalencyjnie ze specyficznym przeciwciałem, które rozpoznaje określony antygen, reaguje z bezbarwnym substratem przekształcając go w barwny produkt. W obecności antygenu kompleks przeciwciało-enzym wiąże się z nim, a enzymatyczny składnik kompleksu przeciwciało-enzym przeprowadzi katalityczną reakcję, w wyniku której powstanie barwny produkt. Obecność barwnego produktu wskazuje więc na istnienie antygenu. Są 2 rodzaje testów typu ELISA : pośredni- jest stosowany do wykrycia obecności przeciwciała. Charakteryzują go następujące etapy: I- Antygen związany jest z podłożem -> dodajemy swoiste przeciwciało związane z antygenem -> enzym połączony z przeciwciałem wiąże się ze swoistym przeciwciałem -> substrat jest dodawany i przekształcony przez barwny produkt, szybkość powstawania barnwego produktu jest proporcjonalna do ilości swoistego przeciwciała. Test warstwy ELISA- umożliwia wykrycie antygenu jak i jego ilościowe oznaczenie. Etapy: I- monokloidalne przeciwciało związane z podłożem -> antygen związany z przeciwciałem -> drugie monokloidalne przeciwciało połączone z enzymem wiąże się z unieruchomionym antygenem -> substrat jest dodawany i przekształcony przez enzym w barwny produkt; szybkość tworzenia kolorowego produktu jest proporcjonalna do ilości antygenu.

PRZECIWCIAŁA:

Obrona organizmu przed obcymi białkami, wirusami, bakteriami. Przeciwciała mają kształt litery Y. Dwie górne kreski to części zmienne które rozpoznają obce substancje, ogonek wysyła sygnał po przyczepieniu się przeciwciała do obcego ciała, sygnał ten rekrutuje inne komórki żerne i markofagi to pomocy.

HEPTEN: Mała cząsteczka które powoduje odpowiedź immunoglobularną

ANTYGENY:

Wywołują odpowiedź immunologiczną, są to obce białka, polisacharydy lub kwasy nukleinowe.

DETERMINACJA ANTYGENOWA- EPITOPY:

Specyficzne grupy rozpoznawane przez przeciwciała.

PRZECIWCIAŁA POLIKLONALNE:

Rozpoznają różne epitopy na tym samym antygenie, produkowane są przez wstrzyknięcie zwierzęciu obcej substancji, są to immunoglobuliny.

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE:

Rozpoznają jeden rodzaj epitopów na antygenie, przeciwciała homogenne, immunoglobuliny, produkowane przez komórki hybrydoma.

ODCZYNNIKI CHEMICZNE:

1. CNBr (bromocyjan) - trawienie wiązań peptydowych po karboksylowej stronie reszt metiolowych

2. mocznik - czynnik denaturujący, odwracalna denaturacja białka pozbawionego mostków disiarczkowych

3. Beta-merkaptoetanol- czynnik denaturujący, odwracalna denaturacja białka zawierającego mostki disiarczkowe

4. Trypsyna - enzym trawiący, proteolityczny, hydroliza wiązań peptydowych po karboksylowej stronie reszt lizynowych i arginionowych.

5. Chymotrypsyna - enzym trawiący, proteolityczny, hydroliza wiązań peptydowych po karboksylowej stronie reszt aromatycznych

6. Chlorek dabsylu - identyfikacja reszty na końcu aminowym peptydu

FERRIMIOGLOBINA (METMIOGLOBINA, UTLENIANA):

• Żelazo na 3 stopniu utlenienia

• Woda związana w 6 pozycji koordynacyjnej

• Histydyna w 5 pozycji koordynacyjnej

OKSYMIOGLOBINA (UTLENOWANA):

• Żelazo na 2 stopniu utlenienia

• Tlen związany w 6 pozycji koordynacyjnej żelaza

• Histydyna w 5 pozycji koordynacjej

DEOKSYMIOGLOBINA (NIEUTLENOWANA):

• Żelazo na 2 stopniu utlenienia

• Pusta 6 pozycja koordynacyjna

• Histydyna w 5 pozycji koordynacjej

MIEJSCA WIĄZANIA HEMU W MIOGLOBINIE:

• Histydyna proksymalna jest zaangażowana w wiązanie żelaza

• Utlenowanie powoduje wprowadzenie O2 w kompleks koordynacyjny z żelazem hemu

• Oddzielenie hemu w niepolarnym środowisku jest ważne w zapobieganiu utlenieniu jonu żelazowego ( wpływaniu wody zapobiega niepolarne środowisko, spowodowane resztami histydynowymi).

RÓŻNICE MIĘDZY HEMOGLOBINĄ A MIOGLOBINĄ

• Hemoglobina jest multimeryczna a mioglobina monomeryczna

• Hemoglobina wiąże CO2 efektywniej niż mioglobina

• Wiązanie O2 przez hemoglobinę zależy od stężenia CO2, H+ i BPG, natomiast w mioglobinie nie.

WSPÓŁCZYNNIK HILLA (n) - kooperatywność wiązania tlenu ( oznacza że wiązanie tlenu w swoistym miejscu jednego łańcucha, zwiększa prawdopodobieństwo tego, że pozostałe łańcuchy rówież zwiążą tlen, n dla hemoglobiny =2,8 dla mioglobiny = 1, kooperatywność powoduje że więcej tlenów może być uwalniane. Są przyjęte skrajne wartości- hemoglobina może wiązać albo bardzo dużo tlenu albo bardzo mało)

pO2/p50 - stosunek oksyhemu do deoksyhemu

p50- ciśnienie cząsteczkowe przy połowicznym wysyceniu tlenem

Y- cząstkowe wysycenie miejsc wiążących tlen

pO2- ciśnienie cząsteczkowe (parcjalne)

WPŁYW CZYNNIKÓW NA POWINOWACTWO HEMOGLOBINY DO TLENU:

PŁUCA	MIĘŚNIE
Stężenie O2- wysokie	Stężenie O2- niskie
Stężenie CO2 - niskie (powinowactwo rośnie)	Stężenie CO2- wysokie (powinowactwo maleje)
Jony H+ (pH) - niskie (powinowactwo rośnie)	Jony H+ (pH) - wysokie (powinowactwo maleje)
BPG obniża powinowactwo hemoglobiny do tlenu

Gdy powinowactwo do tlenu maleje wzrasta skłonność do uwalniania tlenu!

Gdy powinowactwo rośnie wzrasta skłonność do wiązania tlenu!

CO2- wiąże się do N- końca hemoglobiny, wydzielają się jony H+ (dodatkowe zakwaszenie hemoglobiny)

Jony H+ - wiążą się do histydyny na końcu C

CO (czad) - wiążę się tam gdzie tlen (6 pozycja koordynacyjna żelaza)

HISTYDYNA PROKSYMALNA I DYSTALNA:

Każdy z czterech  kationów żelaza  Fe2+ obecnych w cząsteczce hemoglobiny znajduje się wewnątrz niemal całkowicie płaskiej struktury protoporfiryny IX tworzącprostetyczną grupę hemową. Kation Fe2+ jest w grupie hemowej koordynowany przez 4 atomy azotu protoporfiryny. W formie nieutlenowanej piąte wiązanie koordynacyjne jonu żelaza (prostopadle do płaszczyzny grupy hemowej) tworzy tzw. histydyna proksymalna, a szóste miejsce koordynacyjne, po drugiej stronie płaszczyzny jest puste (formie utlenowanej miejsce to zajmuje cząsteczka tlenu O2). Po przeciwnej stronie płaszczyzny niż histydyna proksymalna znajduje się tzw. histydyna dystalna. Nie jest ona związana z grupą prostetyczną jednak odgrywa ważną rolę. Histydyna dystalna zabezpiecza jony żelaza grup hemowych sąsiednich cząsteczek hemoglobiny, aby nie doszło do kontaktu między nimi, chroni jon żelaza przedutlenieniem, gdyż forma utleniona (methemoglobina) nie jest zdolna do skutecznego transportu tlenu. Ponadto histydyna dystalna utrudnia wiązanie się tlenku węgla (CO) do kationu żelaza, co jest szczególnie ważne, gdyż powinowatwo grupy hemowej doczadu jest znacznie wyższe niż do tlenu, a wiązanie CO jest praktycznie nieodwracalne.

BUDOWA HEMU

Hem nadaje mięśniom i krwi koloru czerwonego. Jest zbudowany ze składnika organicznego i położonego w nim centralnie atomu żelaza. Składnik organiczny to protoporfiryna, złożona z 4 pierścieni pirolowych, połączonych mostkami metinowymi w pierścień tetrapirolowy. Do pierścienia przyłączone są 4 grupy metylowe, 2 winylowe i 2 łańcuchy propionianu.

ANEMIA SIERPOWATA

Jest to zmiana pojedyńczego aminokwasu w łańcuchu beta hemoglobiny- reszta waliny wchodzi zamiast reszty glutaminianu w pozycji 6. Powoduje to agregacje erytrocytów i nadawanie im sierpowatego kształtu. Takie erytrocyty nie są w stanie prawidłowo przenosić tlenu. Obecność HbS (zmutowana hemoglobina) powoduje zmniejszenie rozpuszczalności deoksyhemoglobiny.

TALASEMIA

Jest spowodowana utratą lub zmniejszeniem zawartości pojedyńczebo łańcucha hemoglobiny. Wynikiem jest niski poziom funkcjonalności hemoglobiny i zmniejszone wytwarzanie erytrocytów. W talasemii alfa łańcuch alfa nie jest wytwarzany w dostatecznych ilościach, hemoglobina zawiera tylko łańcuchy beta. Te tetrametry wiążą tlen z bardzo silnym powinowactwem i bez kooperatywności. Zatem uwalnianie tlenu w tkankach jest słabe. Analogiczna sytuacja występuje w talasemii beta. Gdy brak łańcuchów beta, łańcuchy alfa wytwarzają nierozpuszczalne agregaty, utrata erytrocytów prowadzi do anemii.

Powinowactwo hemoglobiny płodowej do tlenu jest większe niż powinowactwo matki. Różnica ta pozwala skutecznie przenosić tlen z erytrocytów matki do erytrocytów płodu. Dzieje się tak, ponieważ hemoglobina płodowa nie wiąże 2,3-BPG tak silnie jak hemoglobina matki. Hemoglobina płodowa ma dwie podjednostki- alfa i dwie podjednostki gamma bo zamiast histydyny łączy się z 2,3-BPG seryna, a u matki są dwie podjednostki alfa i dwie beta.

2,3-BPG - występuje w erytrocytach w stężeniu bliskim stężenia hemoglobiny, powstaje w warunkach niedoboru tlenu. Jest ważnym inhibitorem allosterycznym, stabilizuje formę T hemoglobiny (nieutlenioną).

WYTWARZANIE GRADIENTU JONOWEGO:

Błony są w nieznacznym stopniu przepuszczalne dla wody i małych, niepolarnych cząsteczek, natomiast nie przepuszczają makrocząsteczek takich jak kwasy nukleinowe. Kiedy dochodzi do koncentracji makrocząsteczek wewnątrz kompartmentu otoczonego taką półprzepuszczalną błoną, wówczas siły osmotyczne kierują wodę poprzez błonę do jego wnętrza. Bez przeciwciałania takiemu zjawisku napływ wody spowoduje rozerwanie komórki. Mechanizm zapobiegający temu to pompu jonowe zależne od energii. Pompy te mogą zmniejszyć stężenie jonów wewnątrz komórki względem otoczenia, ułatwiając tym samym przepływ wody ze środka na zewnątrz. Wynikający stąd nierówny rozkład jonów w poprzek błony, z natury nieprzepuszczalnej, nazywa się gradientem jonowym. Odpowiednie gradienty jonowe mogą równoważyć siły osmotyczne i utrzymać stałą objętość komórki. Najprawdopodobniej pierwszym składnikiem układu wytwarzającego gradient jonowy były pompa protonowa zależna od ATP. Gradient protonowowy może być sprzężony z innymi gradientami, zapobiegając rozerwaniu komórki.

---