Schemat fazy ciemnej fotosyntezy. Kolorem czerwonym podano nazwy enzymów katalizujących reakcje, kolorem niebieskim podano liczbę cząsteczek biorących udział w poszczególnych reakcjach
Energia zgromadzona w ATP i NADPH wykorzystywana jest do związania CO2 i wytworzenia prostych cukrów. Związki będące produktami fazy ciemnej fotosyntezy zostały szczegółowo poznane dzięki badaniom Melvina Calvina i Andrew Bensona, za co w roku 1961 Calvin otrzymał nagrodę Nobla. Badania te wykazały, że izotop węgla C14 podawany organizmom fotosytetyzującym pojawia się najpierw w związku trójwęglowym - kwasie 3-fosfoglicerynowym. Z tego powodu rośliny, u którym pierwszym produktem asymilacji CO2 jest związek trójwęglowy określa się jako rośliny typu C3[8].
Dwutlenek węgla przyłączany jest do 1,5-bisfosforybulozy. Enzymem katalizującym przyłączenie cząsteczki CO2 jest karboksylaza 1,5-bisfosforybulozy określna też jako karboksydysmutaza lub enzym RuBisCO (ang. ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase)- (EC 4.1.1.39). Enzym ten jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych białek w przyrodzie. W wyniku przyłączenia cząsteczki CO2 do 1,5-bisfosforybulozy powstaje nietrwały związek sześciowęglowy - 1,5-bisfosfo-2-karboksy-3-ketoarabitol, który niemal natychmiast rozpada się na dwie cząsteczki kwasu 3-fosfoglicerynowego.
Kwas 3-fosfoglicerynowy jest fosforylowany ze zużyciem ATP powstającego w fazie jasnej do kwasu 1,3-bisfosfoglicerynowego. Drugi wysokoenergetyczny produkt fazy jasnej jest z kolei zużywany w reakcji redukcji kwasu 1,3-bisfosfoglicerynowego do aldehydu 3-fosfoglicerynowego.
Z aldehydu 3-fosfoglicerynowego oraz pozostającego w stanie równowagi izomeru - fosfodihydroksyacetonu w cyklu reakcji (patrz schemat) z udziałem enzymów przenoszących części łańcuchów węglowych odtwarzany jest akceptor CO2 1,5-bisfosforybuloza. Po związaniu 6 cząsteczek CO2 z cyklu może zostać wyprowadzona 1 cząsteczka heksozy.
Reakcje te zachodzą w stromie chloroplastów i są określane jako cykl Calvina-Bensona. Jest to tzw. faza bezpośrednio niezależna od światła fotosyntezy