FAZA CIEMNA FOTOSYNTEZY = CYKL CALVINA

slajd 2/23

Przemiany cyklu dzielą się na 3 etapy:

I - karboksylacja

II - redukcja

III - regeneracja

Zlokalizowany w stromie.

Reakcje służą asymilacji CO₂ i wbudowywaniu go w związki organiczne. Produktami są cząsteczki trójwęglowe - aldehyd 3-fosfoglicerynowy /GAP/ (powstaje w wyniku I i II etapu)

III etap - dużo reakcji - odtwarzanie pierwotnego akceptora CO₂ czyli

rybulozo-1,5-bisfosforanu

aż 5/6 GAP służy odtworzeniu pierwotnego akceptora

tylko 1/6 GAP to rzeczywisty zysk

slajd 3/23

Etap I to karboksylacja rybulozo-1,5-bisforanu (RuBP)

(przyłączenie CO₂ do czwartego węgla - powstaje bardzo nietrwały związek, który natychmiast rozpada się na 2 cząst. kwasu 3-fosfoglicerynowego)

reakcja jest katalizowana przez karboksylazę/oksygenazę rybulozo-1,5-bisforanu (RUBISCO)

RUBISCO może przyłączać tlen rozpoczynając fotooddychanie

slajd 4/23

RUBISCO roślin wyższych:

• składa się z 8 podjednostek dużych (L, 56 kDa) i z 8 małych (S, 14 kDa)

• każdy łańcuch L zawiera miejsca katalityczne i regulatorowe, które decydują o aktywności enzymatycznej

• podjednostki S zwiększają katalityczną aktywność podj. L

• podj. L (duże) kodowane są przez geny chloroplastowe

• podj. S (małe) kodowane są przez geny jądrowe

• występuje najobficiej w tkankach zielonych - czasem stanowi aż 50% białek liścia

slajd 5/23

aktywacja RUBISCO to proces enzymatyczny wymagający nakładu energii, stymulowany alkalizacją stromy i wzrostem stężenia Mg²⁺

aktywaza RUBISCO związana z ATP wchodzi w interakcję z RUBISCO, następuje hydroliza ATP, dzięki czemu nieaktywna forma RUBISCO przechodzi w aktywną (następuje zmiana konformacji)

RuBP oddysocjowuje, a do reszty ε-aminowej lizyny RUBISCO przyłącza się CO₂ (karbamylacja)

aktywna forma RUBISCO to karbamylo-RUBISCO

slajd 6/23

aktywacja możliwa jest tylko wtedy, gdy zachodzi faza jasna fotosyntezy - w wyniku indukowanego światłem kierunkowego transportu elektronów i protonów przez błony tylakoidów pH lumen spada, a pH stromy rośnie. Transportowi H⁺ do tylakoidów towarzyszy wypływ Mg²⁺ do stromy.

Wysokie pH sprzyja przyłączaniu CO₂ do RUBISCO i tworzeniu karbaminianu oraz przyłączeniu Mg²⁺ (następuje aktywacja)

W ciemności pH stromy spada, a pH lumen rośnie. Następuje transport magnezu do lumen, dekarboksylacja i inaktywacja enzymu.

Brak równowagi cyklu Calvina ma negatywne przełożenie na fazę jasną fotosyntezy - równowaga jest przesunięta w kierunku ATP i zredukowanych form nukleotydów, w chloroplastach brakuje utlenionych form, następuje „przytkanie” łańcucha przekazującego elektrony w fazie jasnej fotosyntezy. Elektrony trafiają na akceptory przypadkowe, np.O₂ i powstają wolne rodniki uszkadzające błony tylakoidowe.

Ważna jest równowaga między fazą ciemną a jasną fotosyntezy. Faza ciemna zależy pośrednio od światła (konkretnie od siły asymilacyjnej powstającej na świetle)

slajd 7/23

Etap II cyklu Calvina to redukcja kwasu 3-fosfoglicerynowego. Zostaje wytworzony pierwszy produkt fazy ciemnej - aldehyd 3-fosfoglicerynowy. W reakcji zużyciu ulegają oba produkty fazy jasnej:

ATP służy do fosforylacji kwasu 3-fosfoglicerynowego

NADPH służy do redukcji kwasu 1,3-difosfoglicerynowego

slajd 8/23

Ostatnim, III etapem fazy ciemnej jest regeneracja. Do tej pory z 3 cząsteczek CO₂ i 3 cząsteczek pentozy (RuBP) otrzymaliśmy 6 cząsteczek aldehydu 3-fosfoglicerynowego /GAP/ (związku trójwęglowego)

Jedna cząst GAP (I) jest zyskiem i służy do syntezy innych związków - sacharozy, skrobi, celulozy, a tym samym do budowy komórek, tkanek, organów (na schemacie to strzałka najbardziej po prawej)

Cząsteczka GAP (II) dzięki izomerazie triozofosforanowej przekształca się w

3-fosfodihydroksyaceton (nadal związek trójwęglowy - C3), który łączy się z kolejną cząsteczką GAP (III) (także C3), dając, dzięki aldolazie, fruktozo-1,6-bisfosforan (C6)

fruktozo-1,6-bisfosforan, dzięki fosfatazie fruktozo-1,6-bisfosforanowej, przekształca się we fruktozo-6-fosforan (C6) - nastąpiło odłączenie jednej reszty fosforanowej

fruktozo-6-fosforan reaguje z kolejną cząsteczką GAP (IV), przekazując na nią kawałek dwuwęglowy. W wyniku tej reakcji, katalizowanej przez transketolazę, z fruktozo-6-fosforanu (C6) powstaje erytrozo-4-fosforan (C4), a z GAP (C3) ksylulozo-5-fosforan (C5)

ksylulozo-5-fosforan przechodzi reorganizację wewnętrzną dzięki epimerazie rybulozo-5-fosforanowej i powstaje rybulozo-5-fosforan (C5)

erytrozo-4-fosforan wchodzi w reakcję z 3-fosfodihydroksyacetonem (powstał z GAP (V) dzięki izomerazie triozofosforanowej) i tworzy się sedoheptulozo-1,7-bisfosforan (C7)

sedoheptulozo-1,7-bisfosforan (C7) dzięki fosfatazie przekształca się w sedoheptulozo-7-fosforan (C7)

sedoheptulozo-7-fosforan (C7) jest dawcą kawałka dwuwęglowego w reakcji z GAP (VI) katalizowanej przez transketolazę. Z sedoheptulozo-7-fosforanu (C7) powstaje rybozo-5-fosforan (C5), a z GAP (C3) ksylulozo-5-fosforan (C5)

ksylulozo-5-fosforan dzięki epimerazie rybulozo-5-fosforanowej przekształca się w rybulozo-5-fosforan

rybozo-5-fosforan dzięki izomerazie rybozo-5-fosforanowej przechodzi w rybulozo-5-fosforan

dzięki tym wszystkim reakcjom uzyskaliśmy 3 cząsteczki rybulozo-5-fosforanu, które to dzięki kinazie rybulozo-5-fosforanowej przekształcają się w 3 cząsteczki rybulozo-1,5-bisfosforanu (RuBP). W tej reakcji następuje zużycie 3 cząst. ATP.

Zaszła pełna regeneracja RuBP (powstały 3 cząst., które mogą przyjąć 3 cząst. CO₂, rozpocznie się więc I etap - karboksylacja)

ALDOLAZY - katalizują kondensację aldolową ketozy (dihydroksyacetonu) z aldozą (GAP)

TRANSKETOLAZY - przenoszą reszty dwuwęglowe (CH₂OH-CO-) z ketozy na aldozę

FOSFATAZY - defosforylują - odłączają resztę fosforanową

KINAZY - fosforyzują - przyłączają resztę fosforanową

slajd 9/23

Regulacja enzymów fazy ciemnej przez system ferredoksyno-tioredoksynowy

(jest zależna od fazy jasnej - w niej następuje redukcja ferredoksyny)

regulacja enzymów przebiega na zasadzie redukcji i utleniania

enzymy podlegające regulacji:

1. RUBISCO

2. dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego

3. fosfataza fruktozo-1,6-bisfosforanu

4. fosfataza sedoheptulozo-1,7-bisfosforanu

5. kinaza fosforybulozowa

Za redukcję odpowiada małe, rozpuszczalne białko ze stromy - tioredoksyna. Zredukowana oddaje protony na mostki siarczkowe S-S w utlenionej formie enzymu, który dzięki temu przechodzi w formę zredukowaną. Tioredoksyna natomiast przechodzi z formy zredukowanej (-SH SH-) w utlenioną (-S-S-).

Ponowna redukcja tioredoksyny jest przeprowadzana przez reduktazę ferredoksyna/tioredoksyna. Równoważnikiem jest ferredoksyna, która zostaje zredukowana w fazie jasnej.

Wiązanie CO₂ jest wielokrotnie wyższe w ciągu dnia niż nocy.

slajd 10/23

RUBISCO jest niedoskonałą karboksylazą, ponieważ w pewnych warunkach do RuBP przyłącza O₂ zamiast CO₂, co powoduje rozpad rybulozo-1,5-bisfosforanu na dwie cząsteczki: fosfoglicerynian (C3) i fosfoglikolan (C2)

Ta reakcja inicjuje fotooddychanie (fotooksydację, oddychanie na świetle) - proces kataboliczny. W naturalnych warunkach zachodzi on podczas spadku stosunku CO₂ do O₂ w przestrzeniach międzykomórkowych tkanek roślinnych (po zamknięciu aparatów szparkowych - np. z powodu zbyt dużego naświetlenia lub wysokiej temperatury)

W atmosferze CO₂ stanowi 0,036%, a O₂ 21%

slajd 11/23

fosfoglikolan (2-phosphoglycolate) jest transportowany z chloroplastów do peroksysomów lub glioksysomów, po drodze ulega defosforylacji do glikolanu.

Glikolan zostaje utleniony do glioksalanu przez oksydazę. Powstaje H₂O₂ rozkładany natychmiast przez katalazę do H₂O i O₂.

Glioksalan jest substratem dla aminotransferaz (przenoszą NH₂). Powstaje z niego glicyna (na dwa sposoby):

1. reszta NH₂ jest pobierana z seryny transportowanej do peroksysomu z mitochondrium (z seryny powstaje hydroksypirogronian, który zostaje w peroksysomie)

2. reszta NH₂ jest pobierana z glutaminianu transportowanego do peroksysomu z chloroplastu (z glutaminianu powstaje α-ketoglutaran, który jest transportowany do chloroplastu)

Dwie cząsteczki glicyny transportowane są do mitochondrium. Jedna dzięki dekarboksylazie i cząsteczce NAD ulega rozpadowi na CO₂ i NH₃, a grupa CH₂ przyłącza się do tetrahydrofolianu (THF, kofaktor szeregu syntetaz wymagających pojedynczych grup węglowych), który przenosi ją na drugą cząst. glicyny tworząc serynę.

Seryna jest transportowana do peroksysomu, gdzie staje się dawcą NH₂ (patrz wyżej- 1) i przechodzi w hydroksypirogronian. Ten ostatni dzięki reduktazie przekształca się w glicerynian transportowany do chloroplastu. Tam glicerynian ulega fosforylacji do 3-fosfoglicerynianu i wchodzi w cykl Calvina.

α-ketoglutaran po transporcie do chloroplastu wchodzi w reakcję z glutaminą (reakcja katalizowana przez aminotransferazę). Powstają dwie cząsteczki glutaminianu. Jedna trafia do peroksysomu gdzie jest dawcą NH₂(patrz wyżej- 2), a druga przyłącza NH₃ wydzielone w mitochondriach z glicyny i przetransportowane następnie do chloroplastu. Przyłączenie NH₃ do glutaminianu i wytworzenie glutaminy zużywa energię w postaci ATP.

Sens fotooddychania:

• dostarczanie aminokwasów

• dostarczanie grup aminowych do aminacji karboksykwasów w chloroplastach

u roślin typu C₃ (nazwa od pierwszego produktu - trójwęglowego związku) istnieje tylko RUBISCO. Fotooddychanie jest przyczyną ograniczonego przyrostu w warunkach nie sprzyjających fotosyntezie (bardzo duże ubytki w masie)

rośliny typu C₄ (pierwszym produktem jest związek czterowęglowy; np. kukurydza) mają zabezpieczenie - oprócz RUBISCO posiadają jeszcze jeden enzym - karboksylazę fosfoenolopirogronianową.(PEP)

slajd 12/23

u roślin C₄ ma miejsce podwójna karboksylacja, podwójne wiązanie CO₂. W komórkach mezofilu dwutlenek węgla z powietrza jest przyłączany do fosfoenolopirogronianu dzięki karboksylazie PEP - powstaje czterowęglowy związek, transportowany następnie do komórek pochwy okołowiązkowej. Tam następuje dekarboksylacja. CO₂ włączany jest do cyklu Calvina (dzięki RUBISCO), a powstały związek trójwęglowy transportowany do kom. mezofilu, gdzie następuje regeneracja fosfoenolopirogronianu.

Karboksylaza PEP ma bardzo wysokie powinowactwo do CO₂ - działa przy takich stężeniach, przy których RUBISCO już wykazuje aktywność oksygenacyjną.

Stężenie CO₂ w komórkach pochwy okołowiązkowej jest stałe, bo stały jest dopływ związku, z którego jest on uwalniany.

Poza tym u roślin C₄ komórki pochwy są ściśle otoczone komórkami mezofilu - CO₂ nie ma jak uciec, brak przestrzeni międzykomórkowych (liczne u roślin C₃)

U roślin C₃ brak też chloroplastów w komórkach pochwy okołowiązkowej, asymilacja CO₂ w miękiszu gąbczastym, bardzo dobrze wentylowanym. (stosunek CO₂/O₂ może być mały)

slajd 13/23

Są trzy typy roślin C₄ (różnią się enzymem dekarboksylującym, uwalniającym CO₂ dla RUBISCO)

1. typu NADP⁺-ME (enzym jabłkowy zależny od NADP⁺)

2. typu NAD⁺-ME (enzym jabłkowy zależny od NAD⁺)

3. typu karboksylaza PEP

pierwszym etapem asymilacji dwutlenku węgla u wszystkich tych roślin jest reakcja:

fosfoenolopirogronian(PEP) + CO₂ karboksylaza PEP szczawiooctan + P_i

1. typu NADP⁺-ME (enzym jabłkowy zależny od NADP⁺)

szczawiooctan zostaje zredukowany do jabłczanu dzięki dehydrogenazie NADP⁺-jabłczanowej (NADPH NADP⁺)

jabłczan zostaje przetransportowany do komórki pochwy okołowiązkowej, gdzie jednocześnie zachodzi dekarboksylacja i utlenienie, dzięki enzymowi jabłkowemu zależnemu od NADP⁺; powstaje pirogronian. CO₂ jest włączany do cyklu Calvina. (NADP⁺ przechodzi w NADPH)

pirogronian zostaje przetransportowany do komórki mezofilu, gdzie zostaje ufosforylowany i odwodniony do fosfoenolopirogronianu

slajd 14/23

2. typu NAD⁺-ME (enzym jabłkowy zależny od NAD⁺)

w tym typie szczawiooctan jest przekształcany do asparaginianu dzięki aminotransferazie asparaginowej (albo glutaminianowej - babka mieszała), która zabiera NH₂ od glutaminianu, przekształcając go w α-ketoglutaran

asparaginian jest przekazywany z komórki mezofilu do komórki pochwy i tam przekształcany rzez tą samą aminotransferazę z powrotem do szczawiooctanu (α-ketoglutaran przyjmuje NH₂ z asparaginianu, powstaje glutaminian)

szczawiooctan dzięki dehydrogenazie NADP⁺-jabłczanowej redukowany jest do jabłczanu (NADPH NADP⁺)

jabłczan dzięki enzymowi jabłkowemu zależnemu od NAD⁺ zostaje utleniony (NAD⁺ NADH), zachodzi także dekarboksylacja (CO₂ wchodzi do cyklu Calvina) i powstaje pirogronian

pirogronian dzięki aminotransferazie alaninowej przyjmuje NH₂ z glutaminianu (ten przechodzi w α-ketoglutaran) i powstaje alanina, transportowana do mezofilu

tam zachodzi proces odwrotny - α-ketoglutaran przyłącza NH₂ z alaniny i staje się glutaminianem, a alanina przechodzi w pirogronian

pirogronian zostaje ufosforylowany i odwodniony do fosfoenolopirogronianu przez dikinazę pirogronian-ortofosforan

slajd 15/23

3. typu karboksylaza PEP

początek tak jak w 2 do momentu wytworzenia szczawiooctanu

szczawiooctan dzięki karboksykinazie PEP ulega dekarboksylacji (CO₂ do cyklu Calvina) i fosforylacji dzięki zużyciu cząsteczki ATP do fosfoenolopirogronianu

ten albo natychmiast jest transportowany do komórek mezofilu, albo zamieniany w alaninę i w takiej postaci transportowany

slajd 16/23

Różnice pomiędzy poszczególnymi typami roślin C₄

	NADP^+-ME	NAD^+-ME	Karboksykinaza PEP
związek (C4) transportowany do pochwy okołowiązkowej	jabłczan	asparaginian	asparaginian
dekarboksylaza	enzym jabłkowy zależny od NADP^+	enzym jabłkowy zależny od NAD^+	karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa
związek (C3) transportowany do komórek mezofilowych	pirogronian	alanina	alanina pirogronian fosfoenolopirogronian

slajd 17/23

Niektóre enzymy cyklu C₄ są aktywowane przez światło.

mechanizm regulujący: odwracalna fosforylacja

1. karboksylaza PEP

na świetle aktywowany zostaje enzym kinaza karboksylazy PEP, który powoduje fosforylację i tym samym aktywację karboksylazy PEP

w ciemności aktywne pozostają fosfatazy (inaktywują karboksylazę PEP)

2. dikinaza pirogronian-ortofosforan (PPDK)

• enzym w formie aktywnej jest nieufosforylowany, fosforylacja go hamuje

• białko regulatorowe, które odpowiedzialne jest za fosforylację i defosforylację enzymu przejawia dwie aktywności - na świetle fosfatazową (defosforyluje), w ciemności kinazową (fosforyluje dikinazę)

mechanizm regulujący: indukcja światłem poprzez system ferredoksyno-tioredoksynowy (taki jak w cyklu Calvina)

3. dehydrogenaza jabłczanowa zależna od NADP⁺

slajd 18/23

Zarówno rośliny C₄ jak i rośliny kwasowe wykazują podwójną karboksylację, różnica polega na rozdzieleniu tych dwóch procesów:

• C₄ : rozdzielenie przestrzenne (kom mezofilu i pochwy okołowiązkowej)

• kwasowe: rozdzielenie czasowe (dzień i noc)

Rośliny kwasowe wywodzą się z klimatów cieplejszych, potrafią wiązać CO₂ przy zamkniętych aparatach szparkowych.

W nocy: aparaty szparkowe są lekko otwarte, następuje asymilacja CO₂. Jego stężenie jest zbyt niskie dla RUBISCO. Działa za to karboksylaza PEP. Powstający jabłczan gromadzi się w wakuoli, obniżając jej pH (stąd nazwa - rośliny kwasowe)

W dzień: jabłczan uwalniany jest do cytoplazmy, działa enzym jabłkowy zależny od NADP⁺, CO₂ włączane jest w cykl Calvina.

slajd 19/23

synteza skrobi i sacharozy:

triozy powstają w chloroplastach, jeżeli tam zostają, dochodzi do syntezy skrobi (nie opuszcza ona chloroplastu), jeżeli trafiają do cytoplazmy zachodzi synteza sacharozy (sacharoza jest formą transportu cukrów w tkankach roślinnych)

za transport trioz z chloroplastu do cytoplazmy odpowiada antyport - w zamian za triozę do chloroplastu wnika nieorganiczny fosforan (stężenie nieorganicznych fosforanów w cytozolu decyduje o wyrzucaniu trioz z chloroplastu)

(nie będę opisywać reakcji, wszystko widać na slajdzie)

inaczej zachodzi aktywacja glukozy (dokładnie glukozo-1-fosforanu) - w chloroplaście dzięki ATP, w cytosolu UTP

slajdy 20-23 nie były omawiane na wykładzie

WYKŁAD: FAZA CIEMNA FOTOSYNTEZY - 7 -

- 7 -

---