SEMINARIUM CZ.I

BIOTECHNOLOGIA ( Bio - organizm żywy, enzym; Technologia - techniczne prowadzenie procesu) - to zintegrowanie nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu zastosowania organizmów, komórek i ich częsci oraz molekularnych analogów do produkcji i usług.

CEL: innowacja, rozwój i optymalizacja procesów w których kataliza enzymatyczna odgrywa kluczową rolę

ZASTOSOWANIE: produkty fermentacji, piekarnictwo, przeróbka skrobi, farmacja, przemysł papierniczy, detergenty, przemysł spożywczy.

BIOTECHNOLOGIA TRADYCYJNA - wykorzystuje naturalne enzymy lub drobnoustroje, komórki organizmów wyższych nie zawierające obcego materiału genetycznego.

BIOTECHNOLOGIA NOWOCZESNA - wykorzystuje szczepy drobnoustrojów lub linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej

TECHNOLOGIA BIOCHEMICZNA

1. przemysł fermentacyjny - browarnictwo, produkcja antybiotyków, białko paszowe, odczynniki chemiczne

2. technologia enzymów - przemysłowe wytwarzanie enzymów

3. technologia odpadów i śmieci

4. Biotechnologia środowiska naturalnego - kontrola skażeń

5. biotechnologia materiałowa i surowcowa

BIOTECHNOLOGIA W POLSCE

- zamienniki cukru

- modyfikacja zawartości słodkiego białka ( ulepszenie smaku) taumatyny w ogórkach; taumatyna - 2500 raza słodsza od sacharozy, rozkładana podczas hydrolizy do aminokawasów

- ziemniaki odporne na choroby wirusowe

- transgeniczne truskawki o przyspieszonym dojrzewaniu

- śliwy odporne na wirusy

-zboża odporna na herbicydy

- rekombinowana insulina ludzka

- otrzymywanie celulozy bakteryjnej wytworzonej przez Acetobacter xylinum o wysokiej elastyczności, ogromnej wytrzymałości machanicznej

- transgeniczny len - lniane włókna zawierają bardzo silne antyoksydanty - przyspieszają gojenie się ran, opóźniają obumieranie komórek krwi, działają bakteriobójczo i zmniejszają liczbę wolnych rodników; do włókien pozyskanych z lnu oleistego wprowadzono geny grzybów z rodziny Aspergillus oraz z pewnych rosnących dziko roślin Ameryki Płd.

ZAKRES ZASTOSOWANIA WSPÓŁCZESNEJ BIOTECHNOLOGII

1. Produkcja żywności

• przemysł spożywczy

- oksydaza glukozowa - utrwalanie żywności

- tradycyjne procesy fermentacji,

- nowe technologie mikrobiologiczne wytwarzania aminokwasów, białek, witamin, nukleotydów, kwasów organicznych, polisacharydów

- zastosowanie enzymów do wytwarzania wyrobów mleczarskich, owocowo - warzywnych

2. Rolnictwo

• Produkcja pasz:

- preparaty białkowe, witaminowe, aminokwasowe, antybiotyczne, stymulatory wzrostu, kiszonki roślinne

• nowoczesne techniki hodowli tkanek i komórek In vitro

3. Ochrona zdrowia

• Namnażanie drobnoustrojów do produkcji przeciwciał, szczepionek

• Produkcja antybiotyków, aminokwasów, kwasów organicznych

• Produkcja leków steroidowych, witaminy C, glukonianu wapnia

• Produkcja hormonów peptydowych

• Produkcja przeciwciał monoklonalnych

4. Analiza

• Zastosowanie enzymów rozpuszczlnych ( oksydazy glukozowej, katalazy, peroksydazy)

• Czujniki enzymowe i komórkowe: oksydaza glukozowa + elektroda tlenowa + ureaza + elektroda Ph

• Analiza genomów: analiza restrykcyjna

5. Przemysł chemiczny i inne

• Wytwarzanie surowców: alkohole, kwasy, polimery

• Bioelektronika - wytwarzanie bioczipów

OSIĄGNIĘCIA BIOTECHNOLOGII

• Mikrobiologiczna produkcja białek ludzkich i zwierzęcych

• Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych

• Unieruchomianie biokatalizatorów

• Stosowanie metod klonowania i rozmnażania roślin In - vitro

ATUTAMI BIOTECHNOLOGII GWARANTUJĄCYMI JEJ ROZWÓJ SĄ:

• Przetwarzanie surowców odnawialnych

• Różnorodność bioprocesów i bioprodukcji

• Selektywne otrzymywanie enancjomerów biologicznie czynnych

• Łagodne warunki przebiegu bioprocesów

• Mała energochłonność

• Duzy stopień bezpieczeństwa bioprocesu

• Łatwiejsza neutralizacja odpadów

RODZAJE BIOPROCESÓW PRZEMYSŁOWYCH

1. BIOSYNTEZA

- drobnoustroje - biosynteza aminokwasów, antybiotyków, polisacharydów

- komórki zwierzęce - otrzymywanie szczepów wirusowych, przeciwciał monoklonalnych

- komórki roślinne - biosynteza dekstryn

2. BIOTRANSFORMACJA

- drobnoustroje - biosynteza steroidów, otrzymywanie kwasu octowego

- enzymy - konwersja glukozy do fruktozy

3. BIOHYDROLIZA

- hydroliza skrobi, laktozy

4. FERMENTACJA

- wykorzystanie drobnoustrojów do produkcji etanolu

PRZYCZYNY WYKORZYSTANIA DROBNOZUSTROJÓW JAKO PRODUCENTÓW ENZYMÓW

• Niskie koszty produkcji

• Wytwarzanie enzymów o wysokiej specyficznej aktywności

• Krótki czas produkcji

• Uniezależnienie od wahań klimatycznych i sezonowych

• Wytwarzanie wielorakich enzymów o szerokim zakresie właściwości np. optimum Ph, odporność na temperaturę

• Wysoka wydajność produkcji

POZYSKIWANIE MIKROORGANIZMÓW

POZYSKIWANIE SZCZEPÓW O ZNACZENIU BIOTECHNOLOGICZNYM - SKINING

1. IZOLACJA I SELEKCJA DROBNOUSTROJÓW

Próbki pobierane są ze środowiska naturalnego: gleby, zbiorników wodnych o dużym zasoleniu itp.

1. ETAPY IZOLACJI

- wybór miejsca i pobranie próbki

- wstępna obróka

- namnażanie i selekcja czystych kultur i pojedynczych komórek

- testowanie przydatności wyizolowanego szczepu to wytwarzania określonego metabolitu

2. WYBÓR METODY IZOLACJI

- próbki ekstrahuje się roztworem soli fizjologicznej z czynnikiem emulgującym Tween 80

- po odpowiednim rozcieńczeniu wysiewa się na płytkę z różnymi podłożami; hodowle stymuluje się przez dobór składników pożywki, warunków hodowli itd.

- antybiotyki bardzo często stosowane są jako czynnik selekcyjny

- podłoża mogą zawierać substraty dla poszczególnych enzymów

3. ETAPY TECHNOLOGII PRODUKCJI PREPARATÓW MIKROBIOLOGICZNYCH

- przygotowanie hodowli tzw. Inokulum drobnoustrojowego produkującego enzym

- zaszczepienie podłoża produkcyjnego

- hodowla powierzchniowa producenta - biosynteza enzymów

- wydzielanie lub zagęszczanie preparatów enzymatycznych

KLASYCZNE METODY DOSKONALENIA CECH BIOTECHNOLOGICZNYCH DROBNOUSTROJÓW

1. ADAPTACJA - polega na indukcji biosyntetycznej zakodowanych w genomie drobnoustroju enzymu lub mutacji prowadzącej do zmiany enzymu normalnie produkowanego i mechanizmu jego kontroli.

2. WYKORZYSTYWANIE MUTACJI INDUKOWANYCH - dobranie odpowiedniego rodzaju mutagenu, jego dawki, czasu ekspozycji; selekcja zmutowanych populacji - wyselekcjonowanie form najbardziej wartościowych podwzględem wydajności określonych metabolitów

3. MATODY RACJONALNEGO SRININGU

- metoda pośrednia - prowadzona w warunkach letalnych dla niepożądanych kultur

- metoda bezpośrednia - warunki dobierane tak, aby produktywność była częściowo ograniczona, umożliwia to łatwiejsze wykrycie szczepów o najwyższej aktywności np. przy hodowli w warunkach hemostatycznych w podłożach zawierających substrat w stężeniach ograniczających wydzielanie produktu lub z dodatkiem innych substancji determinujących rozwój biosyntetyczny.

4) DOSKONALENIE MIKROORGANIZMÓW METODAMI REKOMBINACJI GENETYCZNEJ

- rekombinacja genetyczna polega na łączeniu się cech rodzicielskich w nowe rekombinacje u potomstwa mieszańców

- dwa typy rekombinacji:

a) hybrydyzacja ( krzyżowanie szczepów)

- umożliwia poprawę wielu ważnych cech szczepów przemysłowych ( szybkość wzrostu, tolerancję na różne składniki podłoża itd.)

b) konstruowanie sztucznych kombinacji genów In vitro i uzyskanie ekspresji zaprogramowanej informacji genetycznej w komórkach wybranego gospodarza

HYBRYDYZACJA METODAMI FUZJI PROTOPLASTÓW

1. usunięcie ściany komórkowej na drodze enzymatycznej

2. protoplasty dwóch szczepów miesza się w środowisku alkalicznym w obecności jonów Ca oraz oraz glikolu etylowego - FUZJA

ELEKTROPORACJA I ELEKTROFUZJA

1. działanie na komórki prądem elektrycznycm

2. w przypadku elektroporacji do komórki przenika substancja nie przechodząca przez błonę natywna; w przypadku elektrofuzji wytworzony zostaje mostek cytoplazmatyczny

3. obie metody umożliwiają wprowadzenie kwasów nukleinowych do komórek Procaryota i eucaryota

METODY WPROWADZANIA MATERIAŁU GENETYCZNEGO DO ROŚLIN

1. BEZ WYKORZYSTYWANIA WEKTORA

- mikrowstrzeliwanie - metoda fizyczna realizowana przy pomocy armatki genowej

- mikroiniekcja

- fuzja liposomów - tworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA, przy wstrząsie powstają kuleczki błonowe z DNA w środku, liposomy łączą się z protoplastami komórek i wprowadzają DNA do środka

ETAPY PROCESU BIOTECHNOLOGICZNEGO

PRZYGOTOWANIE ZASZCZEPU ROBOCZEGO:

- hodowla na skosach lub płytkach Petriego - namnażanie na podłożu stałym

- przeniesienie kultury z podłoża stałego na pożywkę płynną, w przypadku hodowania mataki ( kultury od początku hodowane na pożywkach płynnych) - kulturę przenosi się do większej objętości pożywki płynnej

- etap przygotowawczy - mycie i dezynfekcja, sterylizacja aparatury, pomieszczeń

- namnażanie materiału posiewowego

-prowadzenie procesu biosyntezy

- wydzielanie i oczyszczanie produktu

- otrzymanie formy handlowej produktu

PARAMETRY PROCESÓW BIOLOGICZNYCH

1. CHARAKTERYSTYKA METERIAŁU MIKROBIOLOGICZNEGO

- ilość biomasy

- morfologia komórki

- wiek komórek

- struktura

- potencjał metaboliczny

- stan fizjologiczny komórki

- parametry molekularne komórki

- mutacja, zakażenie

2. CHARAKTERYSTYKA PODŁOŻA

- charakterystyka chemiczna i fizykochemiczna

- źródło węgla, azotu, fosforu, prekursory, produkty, Ph, potencjał redox

3. WARUNKI OPERACYJNE

- temperatura, ciśnienie

-lepkośc

- pobór mocy

-szybkość mieszania

-napowietrzenie

-dozowanie roztworów

RODZAJE BIOPROCESÓW

- procesy okresowe

- procesy ciągłe

- procesy ciągłe z zasilaniem

ZALETY PROCESÓW CIĄGŁYCH

1. Prowadzenie procesów długo w korzystnych warunkach

2. możliwość regulowania stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podłoza

3. możliwość automatyzacji procesów

4. możliwość maxymalnego wykorzystania aparatury

WADY STOSOWANIA PROCESÓW CIĄGŁYCH

1. degeneracja szczepów lub pojawienie się mutacji

2. trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas

3. niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju drobnoustrojów tworzących skupiska w postaci kłaczków i kuleczek, obrastanie itd.

FERMENTORY

Konstrukcja uwarunkowana jest rodzajem drobnoustrojów stosowanych w procesie i jego wymaganiach fizjologicznych. Najprostsze rozwiązanie to hodowla fermentacyjna stosowana w hodowlach wgłębnych. Na skalę przemysłową wykorzystuje się bioreaktory duże 10 - 1000m3. Każdy bioreaktor wyposażony jest w szereg czujników kontrolno - pomiarowych. Przy wykorzystaniu bioreaktorów istnieje możliwość sterownia procesem. Najczęściej używane są bioreaktory typu air - lift do hodowli zawiesinowej. Ze względu na rodzaj rekacji prowadzonych fermentory możemy podzielić na:

- fermentor enzymatyczny - reaktor membranowy

- fermentor mikrobiologiczny - membranowy lub kolumnowy służący do hodowli komórek

WYDZIELANIE BIOBRODUKTÓW I ICH PREPARATYKA

Typy bioproduktów:

- egzogenne

- endogenne

Etapy wydzielania bioproduktów egzogennych

- wydzielenie komórek drobnoustrojów z pożywki i przeniesienie uzyskanej biomasy na paszę lub jej unieszkodliwienie

- zagęszczenie cieczy pohodowlanej i jej suszenie - wytrącanie, ultrafiltracja,zagęszczanie termiczno - próżniowe, destylacja

Etapy wydzielania bioproduktów endogennych:

- wydzielenie komórek drobnoustrojów - wirowanie, filtracja

- dezintegracja komórek

- rozdzielenie elementów komórkowych - ultra wirowanie

- rozdzielenie bo produktów znajdujących się w roztworze - ekstrakcja, koncentracja, destylacja, oczyszczanie

EKSTRAKCJA ENZYMOW Z KOMÓREK

1. METODY FIZYCZNE: szok termiczny, schłodzony aceton, ultradźwięki, homogenizacja

2. METODY CHEMICZNE: kwasy, sole, detergenty z obojętnymi czynnikami chaltującymi

3. METODY ENZYMATYCZNE: dodanie enzymów hydrolitycznych ( lizozym, muraminaza, glukonaza), liza bakteriofaga

Homogenizacja prowadzona jest w temperaturze 0 - 4 st. C z dodatkiem proteaz. W przypadku komórek bakteryjnych prowadzona jest sonifikacja (Metoda używana do dezintegracji bakterii np. Escherichia. coli, Bacillus subtilis,

Klebsiella pneumoniae i komórek zwierzecych np. mózgu. W metodzie tej wykorzystuje

sie wibracje tzw. fale kawitacji wywoływane w roztworze przez ultradzwieki, które

mechanicznie uszkadzaja sciane komórkowa. Wielkosc wibracji musi byc utrzymywana

na takim poziomie aby nie powodowac tworzenia sie piany poniewa_ wywołuje to natlenienie roztworu co z kolei mo_e prowadzic do denaturacji białek. Sonifikator składa

sie z sondy i układu elektronicznego kontrolujacego poziom ultradzwieków (patrz Rys.

2). Jednym z ograniczen metody jest ilosc komórek, która nie mo_e przekroczyc ok 1 g

na cykl. W czasie sonifikacji konieczne jest równie_ chłodzenie zawiesiny komórek

przez np. zanurzenie naczynia w mieszaninie woda-lód.). Zamrażanie/rozmrażanie komórek uszkadza ściany i blony komórkowe poprzez wzrost objętości zamarzającej wody i wytworzenie kryształków. Metoda ta słuzy do izolacji enzymów opornych na denaturację. Dodatkowo dodaje się proteazy. Ekstrakcja powinna być prowadzona w łagodnych warunkach i temp. 0 - 4 st. C.

Frakcjonowanie roztworami soli - stopniowe wytrącanie białek

• FRAKCJONOWANIE SOLAMI NIEORGANICZNYMI

- frakcjonowanie powinno się odbywać w temperaturze 2 - 4 st. C

- Ph powinno być odległe od punktu izoelektrycznego

- należy dobrać przedzial stężenia soli

- najcześciej wykorzystywane siarczan amonu, siarczan magnezu, siarczan sodu

- białko wytrąca się w 80 - 90 %

• FRAKCJONOWANIE ROZPUSZCZALNIKAMI ORGANICZNYMI

- wykorzystywane są rozpuszczalniki takie jak: aceton etanol

- frakcjonowanie za pomocą dializy w błonie półprzepuszczalnej

Otrzymane osady białkowe oddzielane są metodami filtracji lub wirowania. Potrzebne osady białkowe są rozpuszczane i poddawane działaniu błony półprzepuszczalnej.

Rozdzielenie metabolitów w płynie pohodowlanym lub we frakcji ciekłej uzyskanej z dezintegracji odbywa się z użyciem:

- sita molekularnego

- wymieniaczy jonowych

- chromatografii adsorpcyjnej

- ekstrakcji, wysalania

- wirowania

- destylacji

PRZYKŁADY PROCESOW FEMENTACYJNYCH

Fermentacja może być prowadzona w warunkach tlenowych ( produkcja kwasu mlekowego, propionowego) oraz beztlenowych ( produkcja kwasu octowego, cytrynowego, fumarowego)

• FERMENTACJA OCTOWA

- wykorzystuje bakterie z rodziny Acetobacter i Gluconobacter

- fermentacja prowadzona jest w tem. 25 - 30, oraz przy Ph = 5,4 - 6,2

- fermentacja oparta na niecałkowitym utlenieniu etanolu

• PRODUKCJA PRZEMYSŁOWA KWASU OCTOWEGO

- do produkcji wykorzystywane są dwie metody klasyczne: metoda powierzchniowa ( tzw. Metoda orleańska) i metoda wiązana. Stosowana jest również metoda wgłębna na fermentorach.

- otrzymywany kwas octowy ma max. Stężenie 10 - 15 %

- metodą biologiczną otrzymuje się wyłącznie ocet spożywczy

- przemysłowo kwas otrzymuje się z aldehydu octowego poprzez utlenianie

• PRODUKCJA PRZEMYSŁOWA KWASU MLEKOWEGO

- otrzymywany metodą biologiczną

- najczęściej stosowane surowce do produkcji kwasu mlekowego to melasa buraczana lub trzcinowa, serwatka, ługi posiarczynowe

- fermentacje przeprowadza się przy użyciu bakterii Lactobacillus delbrueckii, L. casei

• PRODUKCJA PRZEMYSŁOWA KWASU JABŁKOWEGO

- produkcja kwasu jabłkowego odbywa się dwustopniowo

- I ETAP: zastosowanie immobilizowanych komórek do otrzymania kwasu fumarowego

- II ETAP: utlenienie kwasu fumarowego do kwasu jabłkowego przy udziale Aspergillus wentii

• PRODUKCJA PRZEMYSŁOWA KWASU GLUKONOWEGO

- synteza oparta na reakcji utleniania glukozy do kwasu glukonowego przez oksydazę glukozową związaną z FAD. Enzym wytwarzany jest przez Aspergillus Niger oraz bakterie z rodzaju Glukonobacter oraz Pseudomonas

• PRODUKCJA ENZYMÓW

- zazwyczaj stosowana jest metoda wgłębna rzadziej powierzchniowa

- surowcami do produkcji są: melasa buraczana, skrobia, mąka kukurydziana, wysłodki

- bardzo ważnym aspektem przy produkcji enzymów jest zapewnienie odpowiedniego mieszania i napowietrzenia mieszaniny w bioreaktorze

- obecnie prowadzone są badania wstępne z użyciem komórek immobilizowanych

• PRODUKCJA OKSYDAZY GLUKOZOWEJ

- produkcja wykorzystuje szczepy Aspergillus Niger oraz bakterie Penicilium sp.

- znalazła zastosowanie w przemyśle spożywczym, winiarstwie, przemyśle farmaceutycznym, analizie biochemicznej

• PRODUKCJA IZOMERAZY GLUKOZOWEJ

- do produkcji wykorzystywany jest szczep Streptomyces olivocinerus

- jest to enzym wewnątrzkomórkowy

- źródłem węgla w hodowli jest glukoza, azotu - sole amonowe, induktorem

produkcji - ksyloza

- hodowla przeprowadzona jest wgłębnie, następnie przeprowadza się dezintegracje następnie precypitacje przy udziale acetonu, siarczanu amonu - frakcjonowanie

białka ( etap precypitacji razy dwa)

ENZYMY STOSOWANE PRZEMYSŁOWO

• Proteazy bakteryjne

- zasadowe: składniki aktywnych proszków do prania

- kwaśne: używane do hydrolizy białek ( produkcja sosu sojowego, hydrolizatów mleka), piekarnictwo, przemysł mięsny, rybny, skórzany ( zmiękczanie skór)

• Alfa - amylazy: upłynnianie skrobi, piekarnictwo, gorzelnictwo

• Glukoamylazy: hydroliza dekstryn

• Glukoizomerazy: otrzymywanie fruktozy z glukozy

• Pektynazy: rozklad pektyn

• Celulazy: scukrzanie celulozy

• Beta - galaktozydazy: produkcja lodów, kremów, koncentratów mleka

• Inwertaza: hydroliza sacharozy, cukiernictwo, produkcja sztucznego miodu

• Lipazy: przemysł spożywczy, skórzany, tekstylny, chemia gospodarcza

• Oksydaza glukozowa: utlenia glukozę, produkcja jaj w proszku, zwiększa trwałość majonezów

ENZYMY STOSOWANE W ANALITYCE

• Dehydrogenaza alkoholowa - oznaczanie alkoholu etylowego

• Heksokinaza, izomeraza fosfoglukozowa - oznaczanie fruktozy

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW

Metodami biotechnologicznymi można otrzymać szereg aminokwasów: lizynę, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, fenyloalaninę, tryptofan, izoleucynę, walinę. Aminokwasy głownie produkowane są przy udziale szczepu Corynebacterium glutamicum. Dzikie szczepy bakterii nie wytwarzają zbyt wielu ilości aminokwasów

• OTRZYMYWANIE KWASU GLUTAMINOWEGO

- otrzymywany głownie przy udziale szczepów Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter

- w zależności od warunków technologicznych stężenie otrzymanego kwasu waha się , ale można otrzymać 100g/dm3 kwasu glutaminowego w pożywce

- w procesie wykorzystuje się mutanty auksotroficzne wymagające do wzrostu gliceroli lub nienasyconych kwasów tłuszczowych

- w produkcji przemysłowej źródłem węgla jest melasa buraczana, azotu - siarczan amonu, amoniak, mocznik

- produkcja prowadzona jest w temp. 30 - 35 st.C, przy Ph początkowym 7 - 8 przez okres 40 - 72 h przy intensywnym napowietrzaniu

• OTZYMYWANIE L - LIZYNY

- przy produkcji przemysłowej wykorzystywane są mutanty Corynebacterium

- produkcje prowadzi się przy bardzo intensywnym napowietrzaniu

- za pożywkę służy soja

IMMOBILIZACJA

IMMOBILIZACJA - to zespół metod, które ograniczają całkowicie lub częściowo swobodę poruszania się określonych atomów, cząsteczek substancji lub materiałów biologicznych na podłożu stałym lub wewnątrz specyficznych struktur.

1. TYPY BIOKATALIZATORÓW UNIERUCHOMIONYCH

- preparaty pojedynczych enzymów

- kompleksy dwóch lub większej ilości enzymów

- całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowych

- struktury subkomórkowe

- żywe komórki z zachowaniem ich aktywności metabolicznej

2. DLACZEGO IMMOBILIZOWANE ENZYMY

- wysoka cena enzymów związana z ich izolacją i oczyszczaniem

- szybka utrata aktywności

- wrażliwość na zmiany warunków fizyko - chemicznych

- pozytywnie wpływają na stabilizowanie białek, co przejawia się zwiekszeniem ich stabilności i odporności na działanie chemicznych czynników denaturujących

- można je stosować w środowisku rozpuszczalników organicznych

- enzymy te można wykorzystywać wielokrotnie, nawet w systemie ciągłym

3. METODY UNIERUCHOMIANIA ENZYMÓW I KOMÓREK

I.

1. METODY FIZYCZNE

Miedzy enzymem/komórka tworzą się wiązania wodorowe, jonowe, oddziaływania Van der Waalsa. Metody te obejmują 3 metody:

1. ADSORPCJA

- metoda prosta, przebiegająca w łagodnych warunkach immobilizowania

- zaleta jest fakt wielokrotnej możliwości użycia adsorbentu

- jako adsorbenty wykorzystywane są minerały i nieorganiczne substraty ( węgiel aktywny, metale, tlenki, szkło, krzem, żel), wymieniacze jonowe ( CM, DEAE)

2. INKLUZJA ( PUŁAPKOWANIE)

- pułapkowane są substraty o niskiej masie czasteczkowej

- czynnik sieciujący - monomer jedno lud dwufunkcyjny poddaje się polimeryzacji w obecności wodnego roztworu enzymu

- stosowane monomery t o: akrylamid, N,N' - metylenobisakrylamid

- jako inicjatory polimeryzacji stosowane są nadsiarczyn i N,N,N,N - tetrametyloetyleno - diamina

3. MIKROKAPSUŁKOWANIE

- białko w postaci enzymu otaczane jest błoną cienką i półprzepuszczalna

- substraty muszą mieć małą masę cząsteczkową

- tą metodą można też unieruchamiać mieszaniny enzymów

2. METODY CHEMICZNE

1. KOPOLIMERYZACJA

- enzymy poddaje się najpierw modyfikacji chemicznej za pomocą substancji posiadających wiązania podwójne, następnie polimeryzacji lub kopolimeryzacji z monomerami jedno - lub dwufunkcyjnymi

- do czynników modyfikujących zaliczamy: chlorki i azydki, bezwodniki lub estry kwasu akrylowego, metakrylowego oraz bromek allilu

2. USIECIOWANIE KOMÓRE/ENZYMÓW

- działanie na enzymy dwu - lub wielofunkcyjnymi odczynnikami celem otrzymania usieciowanych, nierozpuszczalnych pochodnych enzymatycznych

3. IMMOBILIZACJA PRZEZ TWORZENIE WIĄZAŃ KOWALENCYJNYCH

- metoda ta wymaga użycia dwufunkcyjnych związków sieciujących: aldehyd glutarowy, bromocyjan, diaminy

II.

1. UNIERUCHOMIANIE NA POWIERZCHNI NOŚNIKA

- jako nośniki mogą posłużyć szkło porowate, pochodne celulozy, żywice jonowe, DEAE celuloza, bawełna, ziemia okrzemkowa, skały wulkaniczne

2. UNIERUCHOMIANIE WEWNĄTRZ NOŚNIKA

- metoda polega na unieruchomieniu w matrycy żelu, która jest najczęściej w postaci kuleczki lub w formie dysku

3. UNIERUCHOMIANIE BEZ NOŚNIKA

- flokulacja

- niektóre enzymy/komórki mają zdolność do tworzenia samoistnych skupisk, aglomerató

4. ZAMYKANIE WEWNĄTRZ MEMBRAN PÓŁPRZEPUSZCZALNYCH

- enzym zamyka się we wnętrzu kapsułki która imituje naturalną błonę biologiczną

- oddzielony jest od środowiska membraną przegrodową

CECHY NOŚNIKA:

- nośnik powinien być wytrzymały mechanicznie i termicznie

- powinien cechować się stabilnością chemiczną

- powinien być odporny na zmiany ciśnienia, na biodegradację,

- powinien posiadać odpowiednią porowatość

- nie powinien być toksyczny

- powinien odznaczać się hydrofilnościa

- powinien posiadać aktywne grupy chemiczne lub grupy nadające się do aktywacji

- powinien ulegać łatwo regeneracji

- jego koszt wytwarzania powinien cechować się niską ceną

NOŚNIKI

• NIEORGANICZNE: szkła porowate, porowata krzemionka, gleba, piasek

• ORGANICZNE:polimery polisacharydów: celuloza, dekstran, skrobia

• MIESZANE: nośniki krzemionkowe pokryte nośnikami organicznymi( kolagenem, żelatyną); hydroksyapatyt pokryty białkiem

SEMINARIUM CZ. II

STABILNOŚĆ OPERACYJNA ( bardzo ważny parametr)

• Jest podstawowym parametrem technicznym

• Pozwala ocenić celowość stosowania wybranej metody immobilizacji

• Określa czas pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora - mówi ile razy możemy ten preparat użyć w procesie

W czasie procesu technologicznego immobilizowany katalizator stopniowo traci swoją produktywność co jest spowodowane:

• Wymywaniem enzymu ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem matrycy

• Utratą aktywności na skutek zatrzymania lub denaturacji enzymu

• Zanieczyszczenia mikrobiologicznego

• Pogorszeniem się kontaktu substratu z enzymem zanieczyszczenia lub zatkania porów złoża lub mechanicznego zgniatania matrycy

Czynniki wpływające na przydatność immobilizowanych biokatalizatorów w procesie przemysłowym:

Enzym Nośnik

Właściwości biochemiczne charakt. Chemiczn.

Typ kinetyki reakcji właściwości mech.

Metoda imm. Opory ruchu masy stabilizacja operac.

(liczba cykli)

Produktywność

ZASTOSOWANIE ENZYMÓW IMMOBILIZOWANYCH:

• Aminoacylaza - rozdział racemicznej mieszaniny pochodnych acylowych aminokwasów

• Aspartaza - produkcja kwasu L - asparaginowego

• Izomeraza glukozy - konwersja glukozy do fruktozy

• Pektynazy - rozkład pektyn, klarowanie soków, win, piwa

• Glukoamylaza - hydroliza skrobi

• Papaina - zapobieganie wytrącaniu soków w piwie, sokach, winie

• Kwaśne proteinazy - uszlachetnianie smaku sake

• Termolizyna - hydroliza kazeiny, produkcja aspartamu

• Oksydaza glukozowa - biosynteza kwasów organicznych

• Ureaza, peroksydaza, oksydaza glukozowa - zastosowanie w analizie - oznaczanie moczu, kwasu moczowego, glukozy, lipidów, cholesterolu, antybiotyków

• Nitrylaza - produkcja akryl amidu

• acylaza penicylinowa - produkcja penicylin syntetycznych

• tyrozynaza - produkcja L - Dopa

BIOTECHNOLOGIA - BIOSENSORY

BIOCZUJNIKI - sensory chemiczne składające się z dwóch zasadniczych elementów

- warstwy receptorowej w postaci materiału biologicznego ( warstwa służy do rozpoznawania oznaczanego związku)

- przetwornika elektronicznego lub optycznego ( służy do przetłumaczenia sygnału biologicznego na parametr mierzalny)

- receptorami mogą być enzymy, najczęściej w postaci unieruchomionej, mikroorganizmy lub przeciwciała, organelle tkanek zwierzęcych i roślinnych

- na element przetwornikowy ( sensor, czujnik) oddziałują substancje oznaczane ( analit) oraz biologiczny element detekcyjny ( receptor) w wyniku czego powstaje sygnał który jest rejestrowany i przetwarzany

- metody immobilizacji opierają się na kowalencyjnym doczepianiu się do membrany, pułapkowaniu, sieciowaniu

- immobilizując enzymy na powierzchni elektrody otrzymuje się biosensory zdolne do:

• generowania sygnału na podstawie ilości zużytego tlenu, powstającego H2O2, powstającego aldehydu octowego, powstającego NAD

SCHEMAT SENSORA DO OZNACZNIA ALKOHOLU ETYLOWEGO

BIOSENSOR GLUKOZOWY

Zużycie tlenu monitoruje się amperometrycznie w trakcie przemiany glukozy.

Ko immobilizacja katalazy wraz z oksydazą glukozową pozwala na 2 - krotne rozszerzenie układu pomiarowego i usuwanie H2O2.

BIOSENSORY Z ZASTOSOWANIEM BAKTERII

- wykonuje się fizyczne związanie wymazu komórkowego bakterii na powierzchni elementu detekcyjnego

- zazwyczaj komórki bakterii unieruchomione są membraną do dializ lub innym typem membran mikroporowatych

ZASTOSOWANIE

- ten typ przydatny jest do monitorowania trucizn i mutagenów

- w Japonii biosensory z zastosowaniem bakterii znalazły zastosowanie do oznaczania etanolu w piwie i innych napojach alkoholowych. Użyto biosensora z tzw. Elektrodą bakteryjną Acetobacter Xylinum, który utleniał selektywnie etanol do kwasu octowego

- stosowane są również do oznaczania cholesterolu poprzez oznaczanie nadtlenku wodoru ( oksydaza cholesterolowa)

- rejestracja zużutego tlenu pozwala oznaczyć kwas mlekowy ( oksydaza mleczanowa), kwas octowy, lizyę, L - aminokwasy itd.

- stosowany również do oznaczania antybiotyków, pestycydów, witamin, kwasów karboksylowych, związków nieorganicznych, zanieczyszczeń chemicznych, substancji chemicznych

- w medycynie biosensory z wykorzystaniem bakterii stosuje się do ciągłego monitorowania stężenia biocząsteczek w organizmie

PRZY IMMOBILIZACJI KOMÓREK MIKROORGANIZÓW NOŚNIK POWINIEN:

• Pozwalać na szybki ruch różnych co do wielkości molekuł do wnętrza jego struktury

• Posiadać dobrze rozbudowaną powierzchnię dla zapewnienia wysokiego stężenia immobilizatów w jednostce masy

• Być mechanicznie i chemicznie stabilnym

• Być odporny termicznie

• Nie inaktywować immobilizatów

METODY UNIERUCHOMIANIA KOMÓREK

1. WIĄZANIE KOMÓREK NA POWIERZCHNI NOŚNIKA

• Technika fizycznej adsorpcji przez udział elektrostatycznej siły van der Walsa, jonowej, wodorowej

• Nośniki: celuloza, dekstran, pochodne agaraozy, żywice jonowymienne, polichlorek winylu, wióry, szkło porowate, żel krzemionkowy

WIĄZANIE KOMÓREK WEWNĄTRZ NOŚNIKA

• Inkluzja wewnątrz polimeru

• Polimery: alginiany, pektyny, agar, alkohol poliwinylowy, poliakrylamid

3. TWORZENIE AGREGATÓW WIELOKOMÓRKOWYCH ( bez udziału nośnika)

ZALETY PROCESÓW Z UŻYCIEM KOMÓREK IMMOBLIZOWANYCH:

1. ułatwienie prowadzenia procesów ciągłych, ich automatyzacji i kontroli

2. możliwość wielokrotnego użycia komórki

3. tworzenie mniejszej ilości produktów ubocznych

4. zwiększenie specyficzności reakcji enzymatycznej

5. zwiększenie stabilności komórkowej

6. łatwiejsze oddzielenie koncowych produktów od biomasy

7. większa wydajność z jednostkowej objętości bioreaktorów

8. większa selektywność i stabilność enzymów wewnątrzkomórkowych

9. korzystniejsze warunki przenikania tlenu z fazy gazowej

WADY PROCESÓW Z UŻYCIEM KOMÓREK IMMOBILIZOWANYCH

1. trudności z matematycznym modulowaniem procesów

2. ograniczenie dyfuzji i związane z tym trudności w przenikaniu substratów i produktów reakcji enzymatycznej

3. straty aktywności i stabilności komórek oraz reakcji enzymatycznej wraz z upływem czasu

4. brak wystarczających informacji dotyczących fizjologii unieruchomionych drobnoustrojów

5. ciagłe poszukiwanie optymalnychi uniwersalnych nośników

---