Ćwiczenie 5. Badanie wpływu siły elucyjnej fazy ruchomej na rozdzielanie izomerów nitroaniliny.

1. Cel ćwiczeni

Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu siły elucyjnej składu fazy ruchomej na rozdzielenie izomerów nitroaniliny.

2. Wyposażenie stanowiska laboratoryjnego

• Płytki chromatograficzne pokryte żelem krzemionkowym - 6 szt.

• Zlewki o pojemności 100 - 150 cm³ - 5 szt.

• Płytki Petriego - 5 szt.

• Pipety wielowymiarowe - 2 szt.

• Kapilarki szklane - 4 szt.

3. Odczynniki

• Roztwory o-nitroaniliny, m-nitroaniliny, p-nitroaniliny w metanolu

• Faza nieruchoma: żel krzemionkowy na folii aluminiowej

• Fazy ruchome:

• Faza A: heksan

• Faza B: izopropanol + heksan (10:90)

• Faza C: izopropanol _ heksan (20:80)

• Faza D: izopropanol + heksan (30:70)

• Faza E: izopropanol

4. Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotowanie komory chromatograficznej

Do pięciu zlewek wlać po ok. 5 cm³ faz ruchomych (A-E) i przykryć płytkami Petriego.

2. Przygotowanie płytek chromatograficznych

Z folii aluminiowej pokrytej żelem krzemionkowym wyciąć nożyczkami 6 pasków: 5 pasków o wymiarach 1,5 x 7 cm oraz 1 pasek o wymiarze 1,5 x 7 cm. Na każdym z nich zaznaczyć delikatnie ołówkiem linię startu na krótszym brzegu płytki w odległości ok. 2 mm powyżej linii odpowiadającego objętości poszczególnych faz oraz drugą linię -meta- w odległości ok. 5 mm od przeciwległego brzegu płytki.

Na środek linii startu każdej płytki nanieść za pomocą kapilary kropkę mieszaniny izomerów nitroaniliny.

Płytki umieścić w komorach chromatograficznych (zlewkach) i przykryć płytkami Petriego. Chromatogramy rozwijać do chwili osiągnięcia przez czoło fazy ruchomej linii mety. Następnie płytki wyjąć z komór chromatograficznych i wysuszyć.

Na linię startu szóstej płytki nanieść zarówno mieszaninę jak i wzorce izomerów nitroaniliny, zachowując między plamkami ok. 0,5 cm odstępu. Chromatogram rozwijać w wybranej fazie ruchomej, dającej optymalne rozdzielenie izomerów, do chwili osiągnięcia przez czoło fazy ruchomej linii mety. Następnie wyjąć płytkę i wysuszyć, zaznaczając przy tym kontury mieszanin i rozpuszczalnika na płytce.

5. Obserwacje płytek

1. Płytka z fazą ruchomą A - naniesiona mieszanina pozostała na linii startu, powstała jedna plamka. Oznacza to, że najsilniej oddziałuje ona z fazą stacjonarną.

2. Płytka z fazą ruchomą B - naniesiona mieszanina rozdzieliła się na 2 plamki, które odeszły od linii startu na kolejno 0,6cm; 1,6cm;

3. Płytka z fazą ruchomą C - naniesiona mieszanina rozdzieliła się na bardzo słabo widoczne 3 plamki, których granice nie są wyraźnie zaznaczone. Plamki oddaliły się o około 2,5cm; 3,3cm; 4cm od linii startu;

4. Płytka z fazą ruchomą D - naniesiona mieszanina nie rozdzieliła się na plamki i w postaci jednej plamy przesunęła się na odległość 4,3cm od linii startu;

5. Płytka z fazą ruchomą E - naniesiona mieszanina nie rozdzieliła się na plamki i w postaci jednej plamy przesunęła się na odległość 4,6cm od linii startu.

Z obserwacji płytek wynika, że w komorze chromatograficznej z fazą ruchomą C mieszanina rozdzieliła się najlepiej. Zaobserwowaliśmy trzy oddzielne plamki z niezbyt wyraźnie zaznaczonymi granicami między nimi oraz w różnych odcieniach żółci, na podstawie których wnioskujemy, iż jest to mieszanina trzech składników: -orto, -meta, -para. Z tego względu faza ta została przez nas wybrana do dalszych badań. Nie posłużyły nam ku temu celu pozostałe płytki, na których fazy nie rozdzieliły się tak dobrze jak w fazie C. Nie jesteśmy zatem w stanie stwierdzić jakie składniki posiada mieszanina.

Na czystą płytkę o wymiarach 1,5 x 7 cm nanosimy wzorce izomerów nitroaniliny i mieszaninę w kolejności: -orto, -meta, -para, mieszanina, zachowując między nimi odstęp ok. 0,6 cm. Następnie płytkę umieszczamy w komorze chromatograficznej z fazą C i czekamy aż czoło fazy ruchomej osiągnie linię mety. Płytkę wyjmujemy i suszymy.

W trakcie przechodzenia przez fazę stacjonarną próbka rozdziela się na składniki różniące się powinowactwem do adsorbentu prócz jednego (meta). Składniki, które silniej oddziałują z fazą stacjonarną rozmieszczone są w pobliżu linii startu, natomiast składniki słabiej oddziałujące z adsorbentem rozmieszczone są w pobliżu czoła fazy ruchomej.

6. Obliczenia

Współczynnik retencji obliczamy ze wzoru:

R_f = a/b, gdzie:

a - droga migracji substancji [mm]

b - droga przebyta przez fazę ruchomą [mm]

Rf dla fazy:

1. A: kropka pozostaje na linii startu - Rf = 0

2. B: Rf₁= 6/54= 0,11

Rf₂= 16/54= 0,30

3. C: Rf₁= 25/58= 0,43

Rf₂= 33/58= 0,57

Rf₃= 40/58= 0,69

4. D: Rf= 43/56= 0,77

5. E: Rf= 46/54= 0,85

7. Obserwacja płytki z wybraną fazą ruchomą:

Rodzaj plamki		Droga przebyta przez substancję [mm]	Droga przebyta przez czoło fazy ruchomej [mm]	Współczynnik retencji
-orto		42	56	0,75
-meta		29	56	0,52
-para		20	56	0,36
Mieszanina	x	35	56	0,63
		y	28	56	0,5
		z	20	56	0,36

8. Wnioski

Prędkość przemieszczania się każdej substancji jest wielkością indywidualną i zależną od siły oddziaływań z fazami, a więc na płytce chromatograficznej powstają plamki położone w różnej odległości od linii startu.

Współczynnik retencji jest wielkością charakterystyczną dla danej substancji, w określonych warunkach chromatograficznych. Możemy go policzyć dzięki migracji tej substancji.

W trakcie przechodzenia przez fazę stacjonarną próbka rozdziela się na składniki różniące się powinowactwem do adsorbentu. Składniki, które silniej oddziałują z fazą stacjonarną są rozmieszczone w pobliżu linii startu, a słabiej oddziałujące z adsorbentem - rozmieszczają się w pobliżu czoła 2 fazy ruchomej.

Na płytce 6 umieściliśmy mieszaninę oraz 3 składniki nitroaniliny( orta, meta, para). Mieszanina została rozdzielona na 3 składniki, dzięki nim można stwierdzić, że jest ona mieszaniną trzech wzorców.

Jednak przy porównaniu współczynnika retencji powstałych adsorbentów wyniki wyszły niezgodne. Składniki orta i para wyszły prawidłowo lecz wynik mety wyszedł podobnie, jak wynik DNA naszej mieszaniny. Wynika z tego, że przeprowadzone doświadczenie było wykonane z niedokładnością. Również błąd może wynikać ze złego wyboru komory z fazą ruchomą.

---