Sekwencja palindromowa w genetyce oznacza taką sekwencję DNA dla której sekwencja komplementarna jest identyczna (przy założeniu, że obie sekwencje czytamy z uwzględnieniem polarności nici; zgodnie z przyjętym obyczajem - od końca 5' do 3'):

5' A A T T 3'

3' T T A A 5'

lub

5' A G G C C T 3'

3' T C C G G A 5'

Podział enzymów restrykcyjnych:

1. - Izoschizomery - rozpoznają identyczne sekwencje nukleotydowe. Różnią się optimum działania: pH, temp, skład środowiska. Pochodzą z różnych bakterii.

- Neoschizomery - rozpoznają różne sekwencje nukleotydowi. Działają w identycznych warunkach (pH, temp, skład środowiska)

2. - Enzymy dające tępe końce

- Enzymy dające lepkie końce

PCR-RFLP - PCR + polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Wykorzystywana do wykrywania znanych mutacji punktowych (SNP - single nucleotide polymorphism).

Metoda ta opiera się na wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych (inaczej restryktazy. Enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Rozpoznawana sekwencja z reguły ma charakter symetryczny o długości od 4 do 8 par zasad (pz), choć zdarzają się częste wyjątki).

Wybierając dany enzym restrykcyjny musimy znać jego zachowanie w stosunku do sekwencji prawidłowej=DZIKIEJ i takiej, która zwiera mutację. Zachowanie oznacza sposób cięcia danego fragmentu.

Jak sama nazwa wskazuje w PCR-RFLP pierwszym etapem jest wykonanie PCR, czyli zwiększenie ilości badanego materiału. Zakładamy, że wybrany przez nas enzym restrykcyjny zachowuje się w następujący sposób:

• sekwencja prawidłowa - cięcie DNA w jednym miejscu

Fragment A Fragment B

• 
  
  
  
  sekwencja zmutowana - cięcie DNA w dwóch miejscach

Fr. C Fr. D Fr. E

Musimy teraz zanalizować POLIMORFIZM DŁUGOŚCI FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNYCH (RFLP). Musimy w jakiś sposób rozdzielić powstałe fragmenty.

Wykorzystujemy do tego ELEKTROFOREZĘ.

Wynik dla sekwencji prawidłowej (dzikiej) będzie taki:

Oznacza to, że nasz fragment DNA został pocięty przez dany enzym restrykcyjny na dwie części (jedno miejsce cięcia). Reakcja PCR była potrzebna po to, by widoczne były prążki. Gdybyśmy pominęli etap PCR, materiału byłoby tak mało, że po elektroforezie nic byśmy nie zobaczyli.

Prążek leżący bliżej miejsca nałożenia próbki (1) odpowiada fragmentowi B - w naszym przykładzie ma on większą masę niż fragment A dlatego porusza się wolniej, stawia większy opór w czasie wędrówki w żelu.

Prążek leżący dalej od miejsca nałożenia próbki (2) odpowiada fragmentowi A - mniejsza masa, szybciej wędruje.

Wynik dla sekwencji zmutowanej będzie taki:

Taki rozkład oznacza, że enzym restrykcyjny przeciął nasz fragment na 3 części (dwa miejsca cięcia).

Prążek 1 odpowiada fragmentowi C.

Prążek 2 odpowiada fragmentowi D.

Prążek 3 odpowiada fragmentowi E.

Rozłożenie prążków w elektroforezie na tej samej zasadzie jak w przykładzie dla sekwencji prawidłowej.

Dobierając konkretny enzym restrykcyjny do PCR-RFLP musimy pamiętać, aby sposób jego cięcia był taki, aby powstawały fragmenty różniące się między sobą długością (masą). Gdyby dany fragment był cięty na pół w rozkładzie elektroforetycznym uzyskalibyśmy jeden prążek mimo, że są dwie części (taka sama długość=masa to samo zachwoanie w elektroforezie).

Należy pamiętać także, że dany fragment będzie pocięty przez jeden enzym w dany konkretny sposób (np. jedno cięcie dla sekwencji prawidłowej, 2 cięcia dla sekwencji zmutowanej) a w inny sposób przez inny enzym restrykcyjny (np. jedno cięcie dla sekwencji zmutowanej, dwa cięcia dla sekwencji prawidłowej), jeszcze inny zachowa się tak: wystąpienie mutacji spowoduje brak cięcia, sekwencja prawidłowa występowanie trzech miejsc restrykcyjnych. Dlatego ważne jest abyśmy znali zachowanie konkretnego enzymu restrykcyjnego w stosunku do określonego fragmentu z mutacją i bez niej. Dzięki temu możemy wyciągnąć wnioski z rozkładu elektroforetycznego.

Omówienie schematu techniki PCR-RFLP ze strony 38.

W przykładzie założono, że wybrany enzym restrykcyjny w przypadku:

• Sekwencji prawidłowej tnie fragment w jednym miejscu

• Sekwencji zmutowanej nie tnie (brak miejsca restrykcyjnego)

Poniżej przedstawiono schemat dwóch alleli jednego genu:

Allel 1 - prawidłowy (miejsce restrykcyjne obecne)

Allel 2 - zmutowany (brak miejsca restrykcyjnego)

Allel 1

Allel 2

Pod wpływem enzymu restrykcyjnego następuje cięcie:

Allel 1:

Fr .A Fr. B

Allel 2:

Przeprowadzamy elektroforezę:

Prążek 1 - odpowiada fragmentowi w postaci Allelu 2

Prążek 2 - odpowiada fragmentowi B

Prążek 3 - odpowiada fragmentowi A

Powyższy schemat przedstawiał przypadek Allel 1 zdrowy, Allel 2 zmutowany.

Jest to heterozygota jeśli chodzi o mutację.

Inne warianty, jakie mogą dotyczyć dwóch alleli mogą być następujące:

1. Allel 1 zmutowany, allel 2 zmutowany - homozygota (mutacja)

Allel 1

Allel 2

Enzym restrykcyjny nie przetnie fragmentu z powodu mutacji

Rozkład elektroforetyczny będzie następujący:

Prążek blisko miejsca nałożenia próbki z powodu dużej masy - odpowiada allelowi 1 i 2

2. Allel 1 zdrowy, allel 2 zdrowy - homozygota (zdrowa)

Allel 1

Allel 2

Enzym restrykcyjny przetnie oba fragmenty

Rozkład elektroforetyczny będzie następujący:

Prążek 1 odpowiada fragmentowi dłuższemu (cięższemu) powstałemu po działaniu enzymu restrykcyjnego.

Prążek 2 odpowiada fragmentowi krótszemu (lżejszemu).

Sothern Blot

Wykorzystuje enzymy restrykcyjne ale nie przeprowadzamy wcześniej powielenia krótkiego fragmentu. Wykonujemy replikację CAŁEGO GENOMU.

1. Po zadziałaniu enzymu restrykcyjnego powstają ogromne ilości różnych fragmentów.

Schemat zreplikowanego genomu Wiele fragmentów DNA

2. Dokonujemy rozdziału w elektroforezie.

3. 
   
   
   
   
   
   
   
   
   Denaturacja (podwójne nici DNA rozpadają się na pojedyncze) i przeniesienie na błonę nitrocelulozową

4. Inkubacja błony z radioaktywną sondą

RADIOAKTYWNA SONDA to fragment DNA komplementarny do poszukiwanego fragmentu DNA w próbce badanej (radioaktywna-ma pierwiastek radioaktywny). Działa na zasadzie: znajdę komplementarną sekwencję i przyklejam się do niej = HYBRYDYZACJA

W powyższym przykładzie komplementarność sondy i fragmentu zachodzi jedynie dla ostatniego prążka.

5. Należy przemyć błonę, by odpłukać nie przyłączone sondy (pozostają jedynie sondy `przyklejone' - w tym wypadku do fragmentów tworzących ostatni prążek).

6. Do błony nitrocelulozowej przykładamy BŁONĘ FOTOGRAFICZNĄ. W tym miejscu wykorzystujemy radioaktywność sondy - na błonie fotograficznej powstanie zaczernienie. W ten sposób sprawdzimy, do których fragmentów (który prążek) sonda była komplementarna.

Błona fotograficzna

W powyższym przykładzie założyliśmy, że komplementarność zachodzi dla ostatniego prążka dla ułatwienia zrozumienia metody. W Southern Blot powstaje ostatecznie wzór prążków unikalny i charakterystyczny dla każdego człowieka.

STR - short tandem repeats

Badamy polimorfizm długości krótkich fragmentów powtórzonych.

W ludzkim genomie znajdują się fragmenty DNA zbudowane z licznych powtarzających się sekwencji kilku nukleotydów.

Ilość takich powtórzeń jest zmienna i unikalna dla każdej osoby.

Projektujemy PRIMERY - lepszym określeniem jest SONDA MOLEKULARNA, tak aby były komplementarne do poszukiwanego fragmentu.

Jeśli nukleotydy tworzące fragment powtarzający się mają sekwencję AATG, to sonda ma budowę TTAC

Hybrydyzacja sondy z komplementarnym fragmentem.

Teraz należy użyć LIGAZY, która połączy sondy ze sobą.

Kolejnym etapem jest odłączenie zespolonych sond. Stosujemy denaturację termiczną.

Należy teraz rozdzielić fragmenty za pomocą elektroforezy (żel poliakrylamidowy).

Prążek 1 odpowiada DNA w którym między innymi są `krótkie fragmenty powtórzone'

Prążek 2 odpowiada zespolonym sondom.

Położenie prążka świadczy o jego masie. W elektroforezie przy STR wykorzystujemy wykalibrowany zestaw:

Kalibracji dokonuje się przez rozdział elektroforetyczny fragmentów o znanej masie (ilości par zasad). Wiedząc gdzie się zatrzymują możemy opisać zestaw, dzięki czemu wykonując właściwą elektroforezę ze skalą możemy określać, jaka jest masa badanych fragmentów. Dostępne są także gotowe zestawy ze skalą.

Jeśli nasz prążek odpowiadający zespolonym sondom zatrzyma się na wysokości przykładowo 20 Da a wiedząc, że jedna sonda molekularna `waży' 5 Da możemy stwierdzić, że 4 sondy wchodzą w skład zespolonego fragmentu sond. Wiemy więc ile jest fragmentów powtórzonych STR.

Jeśli mamy skalę podaną w ilości par zasad, wiedząc, że w skład jednej sondy wchodzą np. 4 nukleotydy również możemy określić ilość sond wchodzących w skład zespolenia: jeśli prążek zatrzymał się na wysokości 60 pz 60 pz/4 pz = 20.

Część praktyczna: Ćwiczenie 1

Nauczyć się o badaniu polimorfizmu insercyjno - delecyjnego genu enzymu konwertującego

Schemat str. 43

II - Insercja Insercja - na dwóch allelach kodujących gen występuje inercja - homozygota zdrowa

ID - Insercja Delecja - na jedyn allelu inercja, na drugim delecja - heterozygota (nosiciel)

DD - Delecja Delecja - na obu allelach delecja - homozygota chora

Na schemacie przedstawiono 3 możliwe warianty rozkładu elektroforetycznego w zależności od występowania / braku występowania mutacji.

Przedstawiony obraz elektroforezy wynika z faktu:

• II

Na obu allelach insercja

Allel 1

Allel 2

W rozkładzie elektroforetycznym widzimy tylko jeden prążek na wysokości 487 pz

• ID

W jednym allelu (2) delecja

Allel 1

Allel 2 - delecja

W rozkładzie elektroforetycznym dwa prążki; prążek bliżej miejsca nałożenia próbki odpowiada dłuższemu fragmentowi, dalej - krótszemu.

• DD

Allel 1

Allel 2

W elektroforezie jeden prążek na wysokości 200 pz

Ćwiczenie 2

Nauczyć się Analizy polimorfizmu T174M za pomocą metody RFLP

M - polimorfizm

T - prawidłowe=dzikie

Schemat str. 45

W przypadku polimorfizmu wykorzystany enzym restrykcyjny tnie fragment. (Powstaje więc miejsce restrykcyjne). Powyżej 3 warianty rozkładu elektroforetycznego.

MR-miejsce restrykcyjne

• Prawidłowo (TT) - próbka 3

Allel 1

303 pz

Allel 2

303 pz

• TM - allel 1 prawidłowy (T), allel 2 z mutacją - próbka 1

Allel 1

303 pz

Allel 2 - mutacja

MR

210 pz 93 pz

• MM - allel 1 i 2 z mutacją - próbka 2

Allel 1 - mutacja

MR

210 pz 93 pz

Allel 2 - mutacja

MR

210 pz 93 pz

Enzym restrykcyjny

Enzym restrykcyjny

Miejsce nałożenia próbki

Miejsce nałożenia próbki

Prążek 1

Prążek 2

Prążek 1

Prążek 3

Prążek 2

Miejsce restrykcyjne

Zanik miejsca restrykcyjnego

Miejsce nałożenia próbki.

Prążek 1

Prążek 2

Prążek 3

Miejsce nałożenia próbki.

Miejsce nałożenia próbki.

Prążek 1

Prążek 2

Enzym restrykcyjny

Miejsce nałożenia próbki.

Radioaktywna sonda:

Zakładamy, że fragmenty komplementarne do sondy odpowiadają wskazanemu prążkowi.

Działanie sondy:

Występuje hybrydyzacja sondy i fragmentu

Sondę oczywiście nanosimy na każdy z prążków, ponieważ nie wiemy gdzie znajdują się poszukiwane fragmenty. W tym przykładzie przypadkowo wybrano prążek i pokazano na czym polega działanie sondy.

Zakładamy, że w tym prążku leżą fragmenty, do których sonda nie jest komplementarna (brak hybrydyzacji fragmentów z sondą):

AATG

AATG

AATG

AATG

TTAC

TTAC

TTAC

TTAC

AATG

AATG

AATG

AATG

TTAC

TTAC

TTAC

TTAC

TTAC

TTAC

TTAC

TTAC

AATG

AATG

AATG

AATG

TTAC TTAC TTAC TTAC

AATG

AATG

TTAC TTAC TTAC TTAC

AATG

AATG

AATG

AATG

AATG

AATG

Miejsce nałożenia próbki.

Prążek 1

Prążek 2

100 Da (pz)

80 Da (pz)

60 Da (pz)

40 Da (pz)

20 Da (pz)

Miejsce nałożenia próbki

Marker masy

487 pz

200 pz

Miejsce nałożenie próbki 1

Miejsce nałożenie próbki 2

Miejsce nałożenie próbki 3

II

ID

DD

Insercja

Insercja

Insercja

Fragment, który uległ delecji

Fragment, który uległ delecji

Fragment, który uległ delecji

Miejsce nałożenie próbki 3

Miejsce nałożenie próbki 2

Miejsce nałożenie próbki 1

Marker masy

303 pz

210 pz

93 pz

TM

MM

TT

Rozdział 3 ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE

---