Ćw.1. Oznaczanie nielotnych trucizn organicznych w materiale biologicznym.

Analiza toksykologiczna

Wyodrębnianie trucizn metalicznych :

• Wycinki p.pok., wymiociny, mocz, krew

1. Mineralizacja: trucizny metaliczne w postać jonową

1. Na sucho

Piec elektryczny, 400-500 stopni C, usuniecie wody w suszarce, z dodatkiem utleniaczy: kwas azotowy, azotan potasowy, chloran potasowy.

Złe dla: rtęci, talu, arsenu, antymonu

Dobre dla: magnez, bar, ołow

Mieszanina Mayera: stapianie z węglanu sodowego i azotanu sodowego (2:1) - przy niewielkiej ilości oznaczanego materiału

2. Na mokro

Kwas siarkowy plus utleniacze ( stęż. Kwas azotowy, kwas azotowy, nadchlorowy

)

Małe ilości subst - mieszanina kwasu azotowego i perhydrolu

Metody rozdziału i identyfikacji trucizn metalicznych:

1. Klasyczne - reakcje strąceniowe, potem rozpuszczenie w rozpuszczalnikach - mała czułość, pracowitość

2. Metody chromatograficzne - uniknięcie strat substancji oznaczanej, mniejsze zużycie materiałów

3. Metody ekstrakcyjne - umożliwiają:

1. Zatężenie badanego składnika ( kompleksowanie przy pomocy acetyloacetonu, ditizonu)

2. Oddzielenie go od innych sybstancji mogących interferować

Metody analizy :1.ASA, - cynk, magnez, ołów

2.Polarograficzne

3. Radiometryczne - ozn, ilościowe

4. rozcieńczenia izotopowe - przy małych ilościach substancji

Wyodrebnienie trucizn organicznych:

1. Prygotowanie materiału (usunięcie białek, lipidów, ciał balastowych)

1. Odbiałczanie i odtłuszczenie:

60-100 stopni c, kwas wolframowy, nadchlorowy, siarczan amonowy, kwas winowy

Metody:

1. Siarczanowo-amonowa - w temp. wrzenia wody, dodajemy siarczan amonowy a potem kwas siarkowy ->ph = 4

2. Wolframowa- trucizny kwasne i obojętne

2. Hydroliza- wyodrębnienie związków do postaci wolnej z połączeń z kwasem glukuronowym, siarkowym.

Najczęściej hydroliza kwasna, dla połączeń z glukuronidami możliwość rozłożenia przy pomocy enzymu - glukuronidazy lub proteazy alkalicznej dla leków zasadowych

Wada metody enzymatycznej - długi czas analizy!

Ekstrakcje:

1.Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi:

Prawo podziału Nernsta - podział substancji rozpuszczonej pomiędzy dwie niemieszające się ciecze

Klasyczny tok ->metoda Stass-Otto:

-zakwaszanie kw. Winowym, ogrzewanie z etanolem, 3-4 razy, rozdział roztwóry na grupy:

1. subst. Ekstrahujące się eterem ze środowiska kwasnego (dodajemy NaOH)

2. substancje ekstrahujące się eterem ze środowiska alkalicznego (dodajemy amoniak)

3. trucizny ekstraujące się etrem ze środowiska amoniakalnego (odajemy chloroformu)

4. substancje ekstrahujące się chloroformem ze śr. Amoniakalnego

5. substancje pozostałe w r-rze wodnym

Wady metody:

- czas

- mała wydajność

- duża ilość mat. Biol

- znaczna ilość odczynnikow

-powstawaie emulsji podczas ekstrakcji

II. z użyciem żywic jonowymiennych - SPE ( ekstrakcja do fazy stałej)

• Wyodrębnianie analitów gazowyh, ciekłych , stałych

• Podział między ciekłą fazą ruchomą a adsorbentem

• O skuteczności procesu decydują:

-porowatosc nosnika

-gestosc pokrycia fazą stacjonarną

-rodzaj rozpuszczalnika

Zalety metody w porównaniu z ekstrakcją ciecz -ciecz -> wyzsza selektywosc, czystość ekstraktow, powtarzalność .

Procedura:

1. Kondycjonowanie kolumienek aktywacja materiału wypełniającego (umozliwia powtarzalność oznaczen)

2. Podanie probki optymalnie ok. 250 ml

3. Przemywanie rozpuszczalnikiem,lub innym nie wymywającym roztworem

4. Elucja przemywanie r-rem majacym zdolność wyrugowania oznaczanych związków

III. aeracja - wymywanie pradem powietrza:

- gaz obojętny np. azot, czasem ogrzewany

- roztwory pochłaniające. Wiazące związek w substancje nielotną

- oznaczanie w moczu di siarczku wegla, dichloroetanu, siarkowodoru

IV. mikrodyfuzja

- dyfuzja lotnych związków do rozpuszczalnika, do momentu osiągnięcia równowagi

-krew, osocze, homogenizaty umieszczane w zewnętrznym przedziale naczynka Conwaya

-mozliwosc badan ilościowych i jakościowych

V. wyodrębnianie z parą wodną:

-przeprowadzanie substancji badanej w stan pary przy pomocy pary wodnej fakt sumowania się prężności par składników mieszaniny przeprowadzenie substancji w pare przy cisnieniu rownemu atmosferycznemu

-ze srod. Kwa snego - fosfor, cyjanowodor, chloroform, alkohole, fenole, olejki eteryczne

-ze srod. Zasadowego - efedryna, nikotyna, amfetamina

Metody analityczne w toksykologii

Wyróżniamy 3 podstawowe metody stosowane w toksykologii:

• spektroskopowe = optyczne

• immunologiczne

• chromatograficzne

1. metody spektroskopowe

Zasada ogólna : pomiar zmian właściwości optycznych - absorpcji UV, fluorescencji, luminescencji.

1. spektrofotomeria UV-Vis ( czyli w zakresie nadfioletu i promieniowania widzialnego) :

• jakościowa

• pomiar światła przechodzącego przez próbkę w zależności od długości fali

• otrzymujemy widmo absorpcyjne badanej substancji

• identyfikacja badanej substancji poprzez porównanie otrzymanego widma z widami wzocowymi

• wyróżniamy spektrofotometry klasyczne UV-Vis oraz nowsze spektrofotometry DAD( z matrycą diodową, mierzące absorpcję całego widma w b. krótkim czasie, wynik to chromatogram w 3D : długość fali-absorbancja-czas)

2. spektrofotometria w podczerwieni IR

• jakościowa i ilościowa

• każda substancja organiczna posiada swoje charakterystyczne widmo IR

• stosowana w praktyce w alkomatach, alkotestach

• wyróżniamy spektrofotometrię IR klasyczną i spektrofotometrię IR z transformacją Fouriera czyli FT-IR (wykorzystuje zjawisko interferencji promieniowania podczerwonego, większa rozdzielczość, większa czułość, szybsza analiza)

3. spektrofluorymetria

• do związków aromatycznych ( alkaloidy, barbiturany, salicylany, WWA, ozon)

• pomiar promieniowania emitowanego

• głównie ograniczona jako detektor w HPLC

4. ASA - absorpcyjna spektrometria atomowa

• zasada: atom jest w stanie zaabsorbować takie promieniowanie jakie może wyemitować

• do analizy śladowej metali, niemetali

• prosta, szybka, specyficzna

• wyróżniamy ASA ze względu na rodzaj atomizacji próbki:

- płomieniowa ( atomizacja w płomieniu palnika)

- bezpłomieniowa(ETAA) : z atomizerem elektrotermicznym, o większej czułości, do oznaczania związków ciekłych i stałych

• źródłem promieniowania najczęściej lampa z katodą wnękową( katoda zbudowana z pierwiastka oznaczanego)

• emitowane promien iowanie atomizer( tu wprowadzamy próbkę) monochromator fotopowielacz, układy wzmacniające miernik

5. metody wykorzystujące promieniowanie rentgenowskie:

• wyróżniamy: fluorescencję rentgenowską, elektronową mikroanalizę rentgenowską, metodę pomiaru energii natężenia charakterystycznego prom. X, met. PIXE

2. metody immunologiczne

Mierzymy ilość Ag znakowanego. Mamy różne znaczniki dla Ag: izotopy, związki fluorescencyjne, zw. luminescencyjne, enzymy. Ogólnie dodajemy: znaną ilość Pc, znaną ilość Ag znakowanego(leku) i badany Ag(lek). W tych metodach możemy ominąć etapy rozdziału (ekstrakcję itp.).

Są 2 rodzaje tych metod :

- heterogenne : wymagany rozdział Ag znakowanego połączonego z Pc od Ag znakowanego wolnego. Tego rozdziału dokonujemy poprzez m.in. : absorpcję, strącenie, met. fazy stałej. Np. RIA

- homogenne : bez rozdziału bo różny sygnał od wolnego i związanego Ag. Np. większość pozostałych metod immuno.

1. RIA - met. radioimmunologiczna

• wspłózawodnictwo Ag znakowanego i Ag nieznakowanego o miejsce wiążące w Pc

• znakowanie : 3H, 14C - emitery betta licznik scyntylacyjny w fazie ciekłej

131, 125 I - emitery gamma licznik scyn w fazie ciekłej lub stałej,

może być bez ekstrakcji i oczyszcenia, mniejszy T1/2, roztwory też barwne

• pomiar radioaktytwności

• odmianą met IRMA : niekompetencyjne, z nadmiarem znakowanych Pc

2. optyczne metody immunologiczne

• wykorzystują różnicę sygnałów między wolnym a związanym Ag znakowanym

• najczęściej homogenne ( ELISA heterogenna)

• m.in. enzymatyczne : Ag znakowany enzymem + Pc + substrat + nasza próbka, pomiar zmiany absorpcji, stosowane enzymy : peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, dehydrogenaza G-6-P. ELISA: niekompetencyjna, heterogenna, dodajemy kolejno na Pc opłaszczone na płytce badany Ag, a później Pc znakowane enzymem (tak tworzy się kanapka)

EIA: wplny Ag wypiera Ag znakowany

• fluorescencyjne met. immuno. FIA : pomiar zmiany fluorescencji cząstki, fluoroforem najcz. fluoresceina, rodamina. Zasada metody podobna do RIA (współzawodnictwo).

Oprócz techniki FIA mamy też technikę polaryzacji immunofluorescencji : pomiar zmiany natężenia światła spolaryzowanego.

3. metody chromatograficzne

Zasada ogólna : rozdział substancji pomiędzy fazą ruchomą=eluentem a fazą nieruchomą=stacjonarną. Sorbent na płytce lub jako wypełnienie kolumny( po rozdziale substancje z kolumny są kierowane do detektora)

Rodzaje rozdziału składników mieszaniny:

• chromatografia absorpcyjna - rozdział zgodnie z różnic a absorpcji na fazie stacjonarnej

• chrom podziałowa - rozdział ze względu na współczynnik podziału substancji w 2 niemieszających się cieczach

• chrom sitowa - rozdział ze względu na wielkość cząsteczek rozdzialanych

• chrom jonowymienna - rozdział ze względu na różną siłę oddziaływań jonowych badanej substancji z fazą stacjonarną

Rodzje technik chromatografii w toksykologii:

• TLC - chrom cienkowarstwowa

• GC - chrom gazowa

• HPLC - wysokociśnieniowa chrom cieczowa

czas retencji - czas w którym składnik przechodzi przez całą kolumnę, jest to parametr jakościowy w chromatografii

1. TLC

• dla ozn zw. organicznych i nieorganicznych np. alkaloidy, barbiturany, pochodne fenotiazyny

• prosta, najbardziej popularna

• rozdział składników określamy przez Rf = współczynnik retencji

• podział na cienkich sorbentach umieszczonych na płytce lub folii

• TLC podziałowa : składniki ulegają podziałowi pomiędzy 2 fazy w zależności od ich rozpuszczalności w każdej z nich

• TLC absorpcyjna : absorbentami: żel krzemionkowy ( chrom kwaśna), tlenek glinu(amfoteryczna), węglan wapnia ( zasadowa), węgiel aktywny (obojętna)

• wykonanie TLC:

- wybór rozpuszczalnika(eluentu) z szeregu elutropowego

- przygotowanie płytek

- nanoszenie próbek rozpuszczonych w lotnym rozpuszczalniku + naniesienie wzorców

- rozwijanie chromatogramu : aby wywołać migrację rozpuszczalnika ( wstępujące, zstępujące lub poziome)

- rozdział

- wywołanie : uwidocznienie plamek parami jodu, naświetlaniem UV, radioizotopami lub spryskiwanie specyficznym odczynnikiem dla oznaczanych związków ( ozn. jakościowe)

- analiza ilościowa : zebrać plamkę i wyekstrahować, zastosować sączenie lub wirowanie, po czym można użyć różnych metod t.j. densytometryczna, fluorymetryczna. GC, HPLC, spektrofotometryczna, radioizotopowa

2. GC

• do oznaczania najcz. zw. organicznych ( alkaloidy, leki), monitoring stęż leków

• równoczesne rozdzialenie, oznaczenie jakościowe i ilościowe

• w układzie : gaz-ciecz lub gaz-c.stałe

• etapy:

- wprowadzenie próbki przez dozownik

- odparowanie próbki, mieszanie jej z gazem nośnym

- przechodzenie przez kolumnę chromatograficzną = rozdział w podwyższonej temperaturze ( bo stosujemy piec chromatograficzny w GC)

- detektor

- uzyskujemy chromatogram (piki)

• detektory w GC

- będące jednocześnie samodzielnymi urządzeniami analitycznymi : detektor masowy, emisji atomowej, w podczerwieni lub w podczerwieni z transformacją Fouriera

- jako część chromatografu gazowego selektywne : termojonowy I i II generacji, wychwytu elektronów, płomieniowo-fotometryczny, przewodnictwa elektrolitycznego

- jako część chromatografu gazowego nieselektywne : płomieniowo-jonizacyjne (FID), fotojonizacyjny, katarometr

• metody ilościowego oznaczenia w GC: met. kalibracji, met. wzorca wewnętrznego którym jest ten sam związek co oznaczany, met. wzorca wewnętrznego którym jest inny związek niż oznaczany

• parametr jakościowy - czas retencji

• parametr ilościowy - wysokość piku lub powierzchnia pod pikiem

3. HPLC

• możliwość analizy związków wielkocząsteczkowych, termolabilnych, wysokowrzących

• wypełnienie kolumny najczęściej krzemionkowe

• kolumny konwencjonalne, kapilarne, mikrokapilarne

• wysokociśnieniowa bo wprowadzamy próbkę z użyciem pompy która wytwarza ciśnienie

• tak jak w GC rozdział w kolumnie chromatograficznej

• detektory:

- spektrofotometryczny UV - Vis : najczęstszy

- DAD : z matrycą diodową

- spektrofluorymetryczny

- refraktometryczny, konduktometryczny ( detektory różnicowe, rzadkie)

- MS (masowy) : badanie widma masowego substancji po jej fragmentacji jonowej pod wpływem czynników jonizacyjnych, rozdział w zależności od stosunku masa/ładunek

• analiza ilościowa i jakościowa jak w GC

Toksykologia barbituranów, benzodiazepin i alkaloidów

Toksykologia barbituranów

• Przykłady :Tiopental, Heksobarbital, allobarbital, Amobarbital, Cyklobarbital, Pentobarbital, Fenobarbital.

• Łatwo wchłaniają się z przewodu pokarmowego, jest to związane z ich litofilnym charakterem oraz dużym powinowactwem do białek. Wchłonięte barbiturany prawie równomiernie rozmieszczają się we wszystkich tkankach. Większe ilości gromadzą się w wątrobie(dobre ukrwienie), i w mózgu (dobra rozpuszczalność w lipidach).

• Są induktorami systemu enzymów mikrosomalnych, przyspieszają biotransformacje innych leków.

• Barbiturany powodują zatrucia ostre i przewlekłe.

• Ostre zatrucie: depresyjne działanie na OUN, zaburzenia świadomości, śpiączka, depresja ośrodka oddechowego, hipotermia, zniesienie odruchu kaszlowego, zaburzenie pracy serca i pnia mózgu, spadek ciśnienia tętniczego krwi co prowadzi do niedotlenienia mózgu, wstrząs hipowolemiczny, wygaszenie odruchów rogówkowych i ścięgnistych, upośledzenie funkcji nerek, sinica oraz zmiany zastoinowe krwi żylnej, w bardzo ciężkich zatruciach ustaje perystaltyka jelit. Śmierć następuje w wyniku porażenia ośrodka oddechowego i naczynioruchowego, często z objawami obrzęku płuc.

• Diagnostyka: oznaczenie ilościowe barbituranów w surowicy krwi ( spektrofotometria UV, HPLC). Ocena jakościowa wstępna w moczu ( metody immunologiczne : enzymatyczne lub fluorescencyjne). Testy paskowe.

• Zmiany w wynikach badań towarzyszące zatruciu barbituranami: leukocytoza, zaburzenia RKZ, spadek cukru, białkomocz, wałeczki szkliste i glukoza w moczu, białko w PMR( zniszczenie neuronów) zmiany w EKG.

• Leczenie: płukanie żołądka, forsowana diureza alkaliczna, hemodializy, hemoperfuzja, resuscytacja krążeniowo oddechowa, stosowanie antybiotykoterapi( powikłania płucne)

Toksykologia benzodiazepin

• Przykłady: Dizepam, chlorodiazepam, oksazepam, nitrazepam, temazepam.

• Pochodne benzodiazepiny wchłaniają się dobrze z przewodu pokarmowego. Maksymalne stężenie osiągają po 1-2 h, po wchłonięciu wiążą się odwracalnie z białkami krwi i przemieszczają się do tkanek. Łatwo przenikają przez barierę krew mózg. Większość leków z tej grupy wydala się w ciągu 24-48 h.

• Pochodne benzodiazepiny są lekami o małej toksyczności, często zdarzają się zatrucia o różnym stopniu ciężkości, rzadko jednak kończą się zgonem. Działają na podkorowe struktury mózgu układu limbicznego, pnia mózgu, wzgórza i podwzgórza. Powodują depresje OUN, działają spazmolitycznie.

• Ostre zatrucie: znużenie, zaburzenia równowagi, mowy, widzenia, koordynacji, senność, osłabienie, oczopląs, omamy, drgawki. Możliwe powikłanie to żółtaczka mechaniczna leukopenia i agranulocytoza

• Zatrucie przewlekłe: senność, depresje, niepokój, ataksje ból głowy, niewyraźne widzenie, dolegliwości żołądkowe, wysypka

• Objawy abstynencji: niepokój splątanie myślowe, zaburzenia psychoruchowe, niepokój ruchowy, napięcie, bezsenność, wzmożona agresja, drgawki i majaczenie.

• Duże dawki mogą powodować depresje ośrodka oddechowego w pniu mózgu.

• Diagnostyka: mocz( chromatografia cienkowarstwowa po hydrolizie kwaśnej. Krew: ( GC, HPLC, metody enzymatyczne)

• Leczenie: do 6 h- płukanie żołądka. Nie stosuje się metod przyspieszonej eliminacji, stosujemy odtrutkę FUMAZENIL (antagonista receptorów benzodiazepinowych)

Toksykologia alkaloidów

(z forum wynika że najczęściej pytali o toksykologie strychniny)

• Strychnina: alkaloid pochodzący z nasion kulczyby wroniego oka. Ma silne właściwości toksyczne, stosowany jako trutka na szczury. Charakteryzuje się gorzkim smakiem. Blokuje synapsy hamulcowe, co wzmaga pobudzenie neuronów. Przedawkowanie : drgawki tężcowe, śmierć następuje w skutek uduszenia , w następstwie skurczu tonicznego mięśni oddechowych. ODTRUTKA TO BARBITURANY. Leczenie: sztuczne oddychanie żeby znieść drgawki należy podać luminal.

• Kokaina: alkaloid zawarty w liściach krasnodrzewu peruwiańskiego rosnącego dziko. Objawy ostrego zatrucia: wzrost tętna, CTK, hamowanie przewodzenia impulsów nerwowych, drgawki, lęk, zatrzymanie oddychania, pracy serca. Zwyrodnienie narządów miąższowych.

• Morfina: otrzymuje się ją ze słomy makowej lub opium. Działa depresyjnie na oun, poraża ośrodek oddechowy. Wielokrotne wprowadzanie morfiny do organizmu powoduje spadek wrażliwości neuronów. Zatrucie ostre: senność, zniesienie odruchów, utrata przytomności, płytkim oddech, sinica, silne zwężenie źrenic. Zatrucie przewlekłe : suchość błon śluzowych jamy ustnej i gardła, bóle mięśniowe, nerwobóle, zaparcia i biegunki (na przemian), zmiany zwyrodnieniowe w narządach litych.

• Kofeina :alkaloid występujący w nasionach kawy, liściach herbaty, orzeszkach kola. Mechanizm działania toksycznego : działanie analeptyczce, uczula receptory dopaminy, pobudza oun i ośrodki wegetatywne( oddechowy naczynioruchowy), przyspiesza przemianę materii, pobudza wydzielanie soku żółciowego. Zatrucie ostre: stany silnego pobudzenia psychicznego i ruchowego, drżenie mięśni,szum w uszach, wizje świetlne, nudności, silne bicie serca. Śmierć na skutek porażenia ośrodka oddechowego. Zatrucie przewlekłe: bezsenność nudności, wymioty, niemożność skupienia uwagi, drżenie rąk niemiarowe bicie serca, wzrost potliwości, częstomocz, owrzodzenia żołądka.

Pytania ( dr Moniczewski)

1. Ma Pani zupę pomidorową po chińsku, bo z ryżem jak Pani sprawdzi czy wredna teściowa nie dosypała trucizny do tej zupy? Od czego pani zacznie?

2. Ekstrakcja ogólnie wszystko co wiecie to mówicie

3. Odbiałczanie i odtłuszczanie - trzeba znać odczynniki

4. Metoda TLC to co na ćw robimy, co jest fazą stałą a co ruchomą?

5. Ekstrakcja SP

6. Hydroliza

---