PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 1 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

Egzemplarz nr ……

Podlega aktualizacji.

Opracował(A): Mgr Aleksandra Chomiuk Inż. Zbigniew Osiński Data i podpis

Sprawdził(A): Lek. wet. Monika Przeniosło-Siwczyńska Data i podpis

Zatwierdził(A): Prof. dr hab. Krzysztof Kwiatek Data i podpis

Niniejszy dokument jest własnością PIWet-PIB

Obowiązuje zakaz samowolnego dokonywania zmian treści oraz kopiowania i rozpowszechniania.

PIWet-PIB

Zakład Higieny Pasz

Puławy

Procedura badawcza

nr ZHS/PB-17

Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 2 stron:

Edycja 1

Wersja 1

Obowiązuje od dnia:

Spis treści: 1 Wstęp 1.1 Cel procedury 1.2 Zakres stosowania 1.3 Specyficzne definicje związane z procedurą 1.4 Osoba/osoby odpowiedzialna za stosowanie procedury 1.5 Wymagania dotyczące personelu wykonującego badania 1.6 Wymagania dotyczące warunków środowiska na każdym etapie badania 1.7 Wymagane środki ostrożności 2 Metoda badania 2.1 Zasada metody 2.2 Odczynniki, wzorce lub materiały odniesienia 2.2.1 Odczynniki 2.2.2 Materiały odniesienia 2.2.3 Szkło laboratoryjne 2.3 Wyposażenie pomiarowe 2.3.1 Wymagane przyrządy pomiarowe 2.3.2 Wymagana aparatura pomocnicza 2.4 Wykonanie badania 3 Wyniki 3.1 Sposób zapisywania obserwacji i obliczanie wyników 3.2 Sposób określania i wyrażania niepewności pomiarów 3.3 Sposób wyrażania ostatecznego wyniku badania 3.4 Elementy kontroli i weryfikacji 3.5 Sposób postępowania w przypadku uzyskania wyników niezgodnych 4 Wykaz dokumentów związanych 5 Załączniki 6 Rozdzielnik
PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy	Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej	strona: 3 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

1 Wstęp

1. Cel procedury

Celem procedury jest określenie sposobu postępowania przy wykrywaniu i oznaczaniu zawartości triheptanianu glicerolu (GTH) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego przy użyciu chromatografii gazowej.

2. Zakres stosowania

Procedurę stosuje się do badania przetworzonych produktów pochodzenia zwierzęcego kategorii 1 i 2 (suchych mączek mięsno - kostnych, tłuszczu) znakowanych GTH.

3. Specyficzne definicje związane z procedurą

Produkty uboczne pochodzenia zwierzęcego - całe tusze, części zwierząt lub produkty pochodzenia zwierzęcego nie przeznaczone do spożycia przez ludzi, obejmujące komórki jajowe, zarodki i nasienie.

Materiał Kategorii 1 (szczególnego ryzyka) stanowią:

- wszystkie części ciała łącznie ze skórami zwierząt podejrzanych o zakażenie TSE, zabitych w ramach zwalczania TSE oraz zwierząt dzikich podejrzanych o zakażenie chorobami przenoszącymi się na człowieka lub zwierzęta,

- zwierzęta inne niż gospodarskie, dzikie, oraz zwierzęta towarzyszące, egzotyczne i cyrkowe,

- zwierzęta doświadczalne.

Materiał Kategorii 2 (wysokiego ryzyka) stanowią:

- odchody i treść przewodu pokarmowego,

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 4 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

- materiał zwierzęcy zebrany podczas obróbki ścieków z rzeźni, łącznie z osadami z sit, materiałem powstałym przy odpiaszczaniu, smary i mieszaniny olejów, szlam i materiał usunięty z odpływów z tych pomieszczeń,

- produkty pochodzenia zwierzęcego zawierające pozostałości leków weterynaryjnych,

- zwierzęta lub części zwierząt inne niż w Kategorii 1, które są zabijane w sposób inny niż ubój w celu spożycia przez ludzi, włącznie ze zwierzętami zabijanymi w ramach zwalczania choroby zakaźnej,

- mieszaniny materiałów Kategorii 2 i Kategorii 3,

- uboczne produkty zwierzęce inne niż materiał Kategorii 1 lub materiał Kategorii 3.

GTH - triheptanian glicerolu - jest trójglicerydem zawierającym kwas heksanokarboksylowy-3. Otrzymywany jest z frakcji ropy naftowej wrzącej w temperaturze 40-70 ºC, następnie oczyszczany. GTH jest wiązany we frakcji tłuszczowej i może być wykryty podczas rozdzielania tłuszczu lub mączki zawierającej frakcję tłuszczową. Jest to substancja trwała, odporna na wysokie temperatury autoklawowania. W warunkach normalnych ma postać jasnego klarownego płynu.

GTH jest substancją:

• sztuczną - nie występuje w naturze,

• bezpieczną - ma zastosowanie w przemyśle spożywczym,

• stabilną - podczas przetwarzania jak i przechowywania (nawet do 2 lat),

• znakującą trwale - nie można jej usunąć z oznakowanych materiałów.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 5 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

1. Osoba/osoby odpowiedzialna za stosowanie procedury

-osoba nadzorująca badanie: prof. dr hab. Krzysztof Kwiatek

-zastępstwo: dr Anna Weiner

-osoba wykonująca badanie: mgr Aleksandra Chomiuk

-zastępstwo: lek. wet. Agata Gołębiowska

2. Wymagania dotyczące personelu wykonującego badania

Personel wykonujący badania wg niniejszej procedury powinien znać podstawowe zasady metod chromatograficznych, zapoznać się z obsługą używanej aparatury pomiarowej i pomocniczej. Personel powinien znać procedurę badawczą.

1.6 Wymagania dotyczące warunków środowiska na każdym etapie

badania

Badanie należy wykonywać w temperaturze otoczenia. Nie jest wymagane monitorowanie temperatury.

Większość etapów procesu badawczego należy przeprowadzać pod dygestorium w pomieszczeniu ze skutecznym systemem wentylacji ze względu na stosowanie parujących odczynników oraz gazów nośnych.

1.7 Wymagane środki ostrożności

Należy przestrzegać środków ostrożności wymaganych przy pracy z odczynnikami chemicznymi, aparaturą pomiarową i pomocniczą.

Stosowane łatwolotne i palne odczynniki np. eter naftowy, eter dietylowy wymagają szczególnej ostrożności, przewietrzania pomieszczenia i używania dygestorium.

Na każdym etapie badania wymaga się używania rękawic lateksowych odpornych chemicznie.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 6 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

• Metoda badania

1. Zasada metody

Tłuszcz wraz z GTH ekstrahuje się z próbki eterem naftowym przy użyciu aparatu Soxhleta. Uzyskany ekstrakt rozpuszcza się w n-heksanie i oczyszcza za pomocą modyfikowanych kolumienek SPE. Otrzymany w ten sposób roztwór odparowuje się do sucha, a pozostałość rozpuszcza się w izooktanie i rozcieńcza do odpowiedniego stężenia. Zawartość GTH jest oznaczana przy użyciu chromatografii gazowej. Wykrywanie GTH może być przeprowadzone poprzez połączenie chromatografu gazowego z detektorem spektrometrii mas (MS) lub detektorem płomieniowo - jonizacyjnym (FID). Oznaczenie ilościowe jest możliwe przy użyciu wzorca wewnętrznego (5α- cholestane).

2.2 Odczynniki, wzorce lub materiały odniesienia

2.2.1 Odczynniki

• n-heksan czysty do analiz,

• izooktan czystość do chromatografii gazowej,

• eter dietylowy czysty do analiz,

• eter naftowy, temperatura wrzenia 40-60ºC, czysty do analiz,

2.2.2 Materiały odniesienia

• glyceroltriheptanoate (1,2,3- Trienanthoylglycerol), czystość ≥ 99 % Fluka nr kat. 92855 lub równoważny,

• 5α-cholestane, czystość ≥ 96 %, Fluka nr kat. C8003 lub równoważny.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 7 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

2.2.3 Szkło laboratoryjne

• kolby miarowe 5 ml, 50 ml, 100 ml, 1 l,

• mikrostrzykawki Hamiltona 10 μl,

• probówki szklane z korkiem 5 ml,

• fiolki szklane z nakrętką odpowiednie do stosowanego systemu dozowania,

• zlewki szklane.

1. Wyposażenie pomiarowe

1. Wymagane przyrządy pomiarowe

• waga analityczna do ważenia próbki o zakresie pomiaru pozwalającym na pracę od 0,01g do 200g z dokładnością co najmniej ±0,0001g,

• chromatograf gazowy wyposażony w:

• dozownik z/bez podziału lub bezpośrednio na kolumnę,

• detektor masowy lub płomieniowo - jonizacyjny (FID),

• kolumnę chromatograficzną umożliwiającą rozdział trójglicerydów ( np. DB5, niepolarną, niski przepływ, długość 30m, grubość filmu 0,25μm, średnica wewnętrzna 0,25mm, górna granica temperaturowa 350ºC).

1. Wymagana aparatura pomocnicza

• wyparka próżniowa,

• aparat do ekstrakcji Soxhleta,

• system grzewczy odpowiedni do ogrzewania naczyń z aparatu Soxhleta,

• eksykator,

• suszarka laboratoryjna,

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 8 stron: Edycja1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

• zestaw do ekstrakcji do fazy stałej SPE z kolumienkami amino, 500 mg, pojemność 3 ml,

• wortex,

• sito laboratoryjne o wielkości oczek 1mm,

• dygestorium,

• kamyczki wrzenie.

2.4 Wykonanie badania

2.4.1 Przygotowanie roztworów wzorcowych

W zależności od używanego detektora należy dostosować stężenie roztworów, jak poniżej:

2.4.1.1 Roztwór podstawowy GTH

Odważyć 50 mg, z dokładnością do 0,1 mg, wzorca GTH do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w izooktanie i uzupełnić do kreski. Stężenie docelowe to 1 mg/ml. Roztwór podstawowy GTH przechowywać w chłodziarce nie dłużej niż 6 miesięcy.

2.4.1.2 Roztwór roboczy GTH

0,5 ml roztworu podstawowego GTH o stężeniu 1 mg/ml przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml i uzupełnić do kreski izooktanem. Stężenie docelowe to 0,01 mg/ml.

2.4.1.3 Roztwór roboczy 5α-cholestane

Odważyć 30 mg, z dokładnością do 0,1 mg, wzorca 5α-cholestane do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w izooktanie i uzupełnić do kreski. Stężenie docelowe przy użyciu FID to 0,6 mg/ml. Roztwór wzorcowy 5α-cholestane przechowywać w chłodziarce nie dłużej niż 6 miesięcy.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 9 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

Uwaga:

Przy sporządzaniu roztworów podstawowych i roboczych należy pracować pod wyciągiem, używać środków ochrony osobistej. Końcowe stężenie roztworów podstawowych i roboczych może być dostosowane do specyficznego profilu używanego detektora MS lub FID. Zaleca się przygotowanie świeżych roztworów roboczych każdego dnia.

2.4.1.6 Przygotowanie eluentu do SPE

Wymieszać 850 ml n-heksanu z 150ml eteru dietylowego w kolbie o pojemności 1l.

1. Przygotowanie próbki

Mączkę mięsno - kostną rozdrobnić i przesiać przez sito laboratoryjne o wielkości oczek 1mm. Próbki tłuszczu po rozpuszczeniu są gotowe do dalszej analizy.

2. Ekstrakcja próbki

Odważyć 10 g, z dokładnością do 0,1 g, mączki mięsno - kostnej w czystej gilzie ekstrakcyjnej i umieścić w tubie ekstrakcyjnej aparatu Soxhleta. Do naczynka na rozpuszczalnik aparatu Soxhleta wrzucić kilka kamyczków wrzennych w celu zapewnienia łagodnego wrzenia. Zważyć

naczynko wraz z kamyczkami i zapisać wagę z dokładnością do 0,1 g. Do naczynka wlać 150 ml eteru naftowego. Aparat Soxhleta podłączyć do

źródła zimnej wody i uruchomić system ogrzewania. Prowadzić ekstrakcję ciągłą przez 6 godzin. Po 6 godzinach oddestylować rozpuszczalnik przy użyciu wyparki próżniowej. Wysuszyć pozostałość umieszczając naczynie na 1,5 godziny w suszarce laboratoryjnej. Pozostawić do schłodzenia w eksykatorze, zważyć i zanotować wagę. Suszyć po raz kolejny przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy pozostałego tłuszczu (różnica pomiędzy dwoma kolejnymi masami tłuszczu nie powinna wynosić więcej niż 1 mg).

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 10 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

Uwaga:

Pomiar różnicy wagi naczynia bez i z frakcją tłuszczową pozwala na określenie procentowej zawartości tłuszczu w mączce mięsno - kostnej. Jednakże wielkość ta nie jest wymaganym celem analizy, ponieważ stężenie GTH jest odnoszone do tłuszczu, a nie do pierwotnej matrycy.

2.4.4 Oczyszczanie próbki

Rozpuścić otrzymaną próbkę przetworzonego tłuszczu lub próbkę tłuszczu wyekstrahowanego z mączki mięsno - kostnej. Odważyć 0,5 g, z

dokładnością do 0,01 g, do kolby miarowej o pojemności 5 ml. Uzupełnić n-heksanem do kreski i dobrze wymieszać.

Przygotować szklane probówki, dodać do każdej z nich roztwór roboczy 5α-cholestane (3 μl 0,6 mg/ml dla analizy GC/MS lub 150 μl 0,6 mg/ml dla analizy GC/FID). Umieścić kolumienki SPE w zestawie do ekstrakcji do fazy stałej. Kondycjonować każdą kolumienkę przemywając 7,5 ml n-heksanu. Umieścić probówki pod kolumienkami. Na kolumienkę zadozować 0,2 ml rozcieńczonego tłuszczu. Wymywać 3 ml eluentu do SPE.

Odparować oczyszczony ekstrakt do sucha. Rozpuścić pozostałość w izooktanie (w 1,5ml), probówki zatkać korkiem i worteksować każdą przez 30 sekund. Przenieść końcowy ekstrakt do fiolki szklanej.

2.4.6 Analiza próbki

1. Warunki pracy chromatografu gazowego i detektora

Warunki pracy chromatografu gazowego mogą być różne w zależności od rodzaju używanego detektora, typu dozowania i zainstalowanej kolumny. Muszą one jednak zapewniać rozdział GTH od standardu wewnętrznego.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 11 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

W przypadku detektora masowego, wybranymi masami jonów dla GTH są 299,3 (jon podstawowy) i 285,0 (jon potwierdzający). Wybrane masy jonów dla 5α-cholestane to 217,0 (jon podstawowy) i 372,5 (jon potwierdzający).

Uwaga: Warunki pracy chromatografu gazowego muszą być tak dobrane, aby mieć pewność, że mniej lotne składniki próbki zdążą przejść przez kolumnę przed kolejnym zadozowaniem próbki.

2.4.6.2 Analiza

Parametry metody GC-MS
Gaz nośny	Hel
Kolumna kapilarna	DB-5, 30 m, i.d. 0,25 mm, film 0,25μm
Temperatura detektora	220 ºC
Temperatura dozownika	220 ºC
Piec	Temp. początkowa 90 ºC przez 2 min Przyrost 35 ºC/min Temp. końcowa 325 ºC przez 8 min
Rodzaj jonizacji	EI
Dozowanie próbki	Split 1:12, 2 μl
Tune	Optymalizacja automatyczna

Kolejność analizy powinna wyglądać następująco: jeden zestaw roztworów kalibracyjnych, seria próbek, drugi zestaw roztworów kalibracyjnych.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 12 stron: Edycja1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

• Wyniki

3.1. Sporządzanie krzywej kalibracyjnej

Przygotować serię roztworów kalibracyjnych, których stężenie wyrażone jest w mikrogramach na mililitr, przez rozcieńczenie roztworu podstawowego GTH izooktanem (przykładowe stężenia podano w tabeli 1 ).

Tabela 1. Roztwory do krzywej kalibracyjnej dla detektora MS

Zawartość GTH w tłuszczu, mg/kg	Zawartość GTH roztworze kalibracyjnym, μg/ml	Objętość roztworu roboczego GTH, ml	Objętość roztworu roboczego 5α cholestane, μl	Objętość końcowa roztworu, ml
0	0	0	10	5
75	1	0,5	10	5
150	2	1	10	5
225	3	1,5	10	5
300	4	2	10	5
450	6	3	10	5
600	8	4	10	5

Stężenie analitu w próbce obliczane jest z krzywej kalibracyjnej przedstawiającej zależność stosunku pola pod pikiem badanego analitu i pola pod pikiem standardu wewnętrznego od ilości (stężenia) analitu.

Do obliczania stosowany jest program Excel.

Współczynnik korelacji krzywej wzorcowej powinien być większy niż 0,98.

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 13 stron: Edycja1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

3.2. Sposób określania i wyrażania niepewności pomiarów

Niepewność pomiaru oszacowana została na etapie walidacji. Podaje się ją do każdego wyniku badania.

Sposób podania niepewności: „wynik ± wyliczona niepewność pomiaru w mg/kg”.

3.3. Sposób wyrażania ostatecznego wyniku badania

Wynik jest wyrażony formułą: „W badanej próbce: NAZWA PRÓBKI stwierdzono zawartość GTH w ilości MASA GTH WYRAŻONA W MILIGRAMACH / KILOGRAM masy tłuszczu”.

3.4. Elementy kontroli i weryfikacji

• badania powtórne tej samej próbki,

• badanie próbki „podstawionej” o znanej zawartości analitu.

3.5. Sposób postępowania w przypadku uzyskania wyników niezgodnych

W przypadku otrzymania wyników niezgodnych badanie zostaje powtórzone. Ponowne otrzymanie wyniku niezgodnego sugeruje potrzebę wykonania przeglądu metodyki badawczej oraz podjęcia działań korygujących zgodnie z procedurą ogólną PO-12 „Działania korygujące i zapobiegawcze”.

• Wykaz dokumentów związanych

PIWet-PIB Zakład Higieny Pasz Puławy

Procedura badawcza nr ZHS/PB-17 Oznaczanie TRIHEPTANIANU GLICEROLU (gth) w przetworzonych produktach pochodzenia zwierzęcego PRZY UŻYCIU chromatografii gazowej

strona: 14 stron: Edycja 1 Wersja 1 Obowiązuje od dnia:

• Determination of glyceroltriheptanoate (GTH) in processed animal by-products by gas chromatography.

• PO-12 „Działania korygujące i zapobiegawcze”.

• Załączniki

- Załącznik nr 1

6 Rozdzielnik

Egz. nr 1 Archiwalny

Egz. nr 2 Pełnomocnik ds. Jakości Badań

Egz. nr 3 Kierownik ZHS

Egz. nr 4 Kierownik ds. jakości ZHS

Egz. nr 5 Osoby wykonujące badanie (osoba odpowiedzialna - Aleksandra Chomiuk)

KONIEC

---