Tytuł ćwiczenia: Badanie własności kinetycznych inwertazy (3.2.1.26; fruktohydrolazy β-D-fruktofuranozydów

Karina Stuczeń III rok OŚ

Przebieg doświadczenia:

Przygotowano po 1ml roztworu sacharozy (substratu) o rozcieńczeniach: 125; 62,5; 15,625; 0 mM. Dla każdego ze stężeń substratu przeprowadzono doświadczenie, które przebiegało następująco:

W 5 probówkach umieszczono 200μl odczynnika miedziowego. W probówce reakcyjnej umieszczono 1ml roztworu substratu o pożądanym stężeniu i 500μl buforu octanowego. Następnie włączając pomiar czasu dodano 1ml roboczego roztworu inwertazy, tak by cała zawartość probówki uległa silnemu wymieszaniu. Natychmiast pobrano 200μl i dodano do przygotowanych 200μl roztworu miedziowego. Co 2 minuty przez 8 minut pobierano z mieszaniny próbki i postępowano analogicznie. Serię probówek umieszczono we wrzącej łaźni łaźni wodnej na co najmniej 15 minut, następnie ostudzono, dodano po 200μl odczynnika arsenowo-molibdenowego i silnie wymieszano. Po około 1 minucie dodano 5ml wody. Następnie zmierzono absorbancję względem wody przy λ= 520nm.

Tabela 1. Absorbancje wzorców do sporządzenia krzywej kalibracyjnej przy długości fali λ= 520nm :

C [mM]	A
0	0,002
0,15	0,021
0,3	0,073
0,6	0,116
1,2	0,253
2,4	0,545

Wykres 1. Krzywa kalibracyjna

OBLICZENIA:

C= (Absorbancja+b)/a

C= (Absorbancja+0,0054)/0,2258

1. C= 0mM

Tabela 2. Absorbancja i stężenie roztworu po upływie czasu

T [min]	A	C [mM]
0	0,003	0,0372
2	0,003	0,0372
4	0,003	0,0372
6	0,003	0,0372
8	0,003	0,0372
10	0,003	0,0372

Wykres 2. Zależność stężenia substratu od upływu czasu

2. C= 125mM

Tabela 3. Absorbancja i stężenie roztworu po upływie czasu

t [min]	A	C [mM]
0	0,122	0,5642
2	0,744	3,3189
4	0,954	4,2489
6	0,951	4,2356
8	0,983	4,3773
10	0,997	4,4393

Wykres 3. Zależność stężenia substratu od upływu czasu

3. C= 62,6mM

Tabela 4. Absorbancja i stężenie roztworu po upływie czasu

t [min]	A	C [mM]
0	0,052	0,2542
2	0,28	1,2640
4	0,23	1,0425
6	0,667	2,9779
8	0,538	*2,4066	4,8132
10	0,615	*2,7476	5,4952

* wyniki należy pomnożyć x2, ponieważ roztwór należało rozcieńczyć dwukrotnie, gdyż absorbancja nie mieściła się w skali

Wykres 4. Zależność stężenia substratu od upływu czasu

4. C= 31,25mM

Tabela 5. Absorbancja i stężenie roztworu po upływie czasu

t [min]	A	C [mM]
0	0,050	0,2453
2	0,196	0,8919
4	0,353	1,5872
6	0,487	2,1807
8	0,535	2,3933
10	0,693	3,0930

Wykres 6. Zależność stężenia substratu od upływu czasu

5. C= 15,625mM

Tabela 6. Absorbancja i stężenie roztworu po upływie czasu

t [min]	A	C [mM]
0	0,011	0,0726
2	0,12	0,5554
4	0,206	0,9362
6	0,3	1,3525
8	0,406	1,8220
10	0,452	2,0257

Wykres 6. Zależność stężenia substratu od upływu czasu

6. Zależność odwrotności szybkości reakcji od odwrotności stężenia

V- współczynnik a z wykresów „Zależność stężenia substratu od upływu czasu przy C= ….”

Tabela 7. Szybkość reakcji, stężenie substratu oraz ich odwrotności

V	[S]	1/V	1/[S]
0,1997	15,625	5,007511	0,064
0,2762	31,25	3,620565	0,032
0,5541	62,5	1,804728	0,016
0,3220	125	3,10559	0,008

Wykres 7. Zależność odwrotności szybkości reakcji od odwrotności stężenia

7. Obliczenie Stałej Michaelisa-Menten

Wzór równania Lineweavera-Burka:

Uwzględniając równanie prostej można wyliczyć wartość stałej K_M:

y= ax +b

y= 1/V­­_­0

a= K_M/ V­­_max

x= 1/[S]

b= 1/ V­­_max

Równanie z wykresu:

y = 45,602x + 2,0165, gdzie:

a= 45,602

b= 2,0165

b= 1/ V­­_max

V­­_max= 1/b= 1/2,0165

V_max=0,4959

a= K_M/ V­­_max

45,602= K_M/0,4959

K_M= 45,602x0,4959

K_M= 22,61

Wnioski:

Stała Michaelisa-Menten jest miarą powinowactwa enzymu do substratu. Jej zależność jest odwrotnie proporcjonalna, to znaczy, że im większa wartość K_M, tym mniejsze powinowactwo enzymu do substratu. W przypadku tego doświadczenia stała K_M wynosiła 22,61, jest stosunkowo niewielka, a więc świadczy o tym iż inwertaza ma powinowactwo do sacharozy

6

---