Fermentacja alkoholowa i octowa

Fermentacja jest to beztlenowy (zazwyczaj) proces biochemiczny, polegający na enzymatycznym rozpadzie cukrów, który jest jednym z elementów fizjologii drobnoustrojów. Do przebiegu fermentacji konieczne są drobnoustroje lub wytworzone przez nie enzymy. Do najważniejszych rodzajów fermentacji należą:

• fermentacja alkoholowa

• fermentacja anaerobowa (fermentacja beztlenowa)

• fermentacja spontaniczna

• fermentacja cytrynowa

• fermentacja masłowa

• fermentacja mlekowa

• fermentacja octowa

• fermentacja propionowa

Fermentacja alkoholowa.

Fermentację alkoholową wywołują drożdże (Saccharomyces cerevisiae należące do grzybów, Ascomycetes) oraz niektóre Mucomceae (nazywane niekiedy drożdżami mukorowymi). Naturalnym miejscem bytowania drożdży są rośliny (owoce, nektar kwiatów, wycieki soku). W drodze selekcji otrzymano wiele ras i szczepów przydatnych w przetwórstwie (gorzelnictwo, piwowarstwo, winiarstwo). Drożdże fermentują heksozy oraz niektóre oligosacharydy (np. maltozę i sacharozę). Nie rozkładają skrobi, wykorzystują mineralne źródła azotu. Są dość odporne na obniżone pH i na bezwodnik siarkowy (trójtlenek siarki, reaguje wybuchowo z wodą). Jak widać, kwas pirogronowy ulega tu dekarboksylacji, a powstający aldehyd octowy służy jako akceptor wodorów przyjmowanych od NADH₂, przekształcając się w etanol. Fermentacja ta w środowisku alkalicznym lub w obecności kwaśnego siarczynu sodowego, wiążącego się z aldehydem octowym, przebiega inaczej, z wytwo­rzeniem pewnych ilości glicerolu. Drożdże są względnymi beztlenowcami i w obecności tlenu fermentacja zostaje zahamowana, a drobnoustrój zaczyna od­dychać tlenowo. Sarcina ventriculi prowadzi mieszaną fermentację alkoholową, w której obok etanolu powstają też pewne ilości kwasu octowego, dwutlenku węgla i wodoru.

Fermentacja alkoholowa Zymomonas mobilis

Fermentacja wywołana przez tę bakterię, dawniej zwaną Pseudomonas lindnerii, również rozpoczyna się od przekształceń podobnych do pierwszych etapów cyklu pentozowego. Fermen­tację tę wykorzystuje się do sporządzania napojów alkoholowych w Ameryce środkowej i południowej.

Fermentacja alkoholowa

Prowadzona jest głównie przez drożdże. Za­chodzi ona w warunkach beztlenowych i polega na przerobieniu jednocukrów lub dwucukrów na alkohol etylowy. Oprócz drożdży fermentację alkoholową mogą prowadzić niektóre pleśnie (Mucor i Rhizopus), oraz bakterie (Thermobacterium cereale). Alkohol może też powstawać jako produkt uboczny w innych fermentacjach oraz w procesach oddychania tlenowego niektórych bakterii, jak np. Pseudomonas i Sarcina. Ponieważ drożdże są ściśle spokrewnione z innymi grzybami, często nazywa się je grzybkami drożdżowymi. Wspomniano też, że praktycznie często stosuje się podział na drożdże dzikie, występujące w naturze, i szlachetne, które po­dobnie jak rośliny uprawne są selekcjonowane i uszlachetniane w hodowli laboratoryjnej. W ten sposób przygotowuje się szczepy macierzyste dla różnych działów produkcji przemysłowej opartej na fermentacji alkoho­lowej. Rozróżnia się drożdże winne, piwne, gorzelnicze, paszowe i pie­karnicze. Stawia się im różne wymagania pod względem siły fermenta­cyjnej, zdolności wytwarzania specjalnych aromatów, wydzielania dwutlenku węgla, szybkości klarowania płynu fermentacyjnego itp. W przemyśle gorzelniczym, ma zastosowanie przede wszystkim gatu­nek Saccharomyces cerevisiae. W Polsce do fermentacji zacieru, w róż­nych wytwórniach, używa się najczęściej ras II, XII, M i „Gdańsk", które odznaczają się dużą siłą fermentacyjną, małą wrażliwością na nagroma­dzający się alkohol i stosunkowo słabym wydzielaniem dwutlenku węgla, wywołującego dodatkowo pienienie się fermentowanej masy, uwarunko­wane również składem chemicznym surowca i technologią produkcji. Drożdże stosowane w przemyśle winiarskim powinny również mieć dużą zdolność fermentowania zawartego w moszczu cukru. Oprócz tego drożdże winiarskie powinny produkować substancje nadające winom charakterystyczny dla różnych gatunków „bukiet", smak i zapach. Znane są szlachetne odmiany drożdży winiarskich dwóch gatunków: Saccharomyces cerevisiae i S. bayanus. Drożdże piwowarskie wywołują powolną i słabą fermentację cukru. Będą to różne rasy gatunków S.cerevisiae i S.uvarum. Drożdże paszowe, podobnie jak piekarskie, wykorzystywane są w in­ny sposób. Od drożdży używanych w różnego rodzaju procesach opartych na fermentacji alkoholowej wymaga się przede wszystkim zdolności pro­wadzenia tej fermentacji, a więc wykorzystywania tego procesu jako pro­cesu energetycznego niezbędnego dla wzrostu i rozwoju komórek. Drożdże paszowe i piekarskie powinny być przystosowane do oddychania tleno­wego, które dostarcza więcej energii i pozwala na szybsze rozmnażanie się komórek. W ten sposób uzyskuje się znacznie większą biomasę przy zużyciu tej samej ilości substratu. Substratem dla drożdży paszowych bywają często produkty odpadkowe innych przemysłów, np. cukrownicze­go, drzewnego i papierniczego. Oczywiście macierzyste szczepy drożdży muszą być wtedy przystosowane do wykorzystywania tych substancji jako źródła węgla i energii. Poza tym dobiera się takie rasy, które są zdolne do syntetyzowania łatwo strawnego tłuszczu i białka oraz witamin z grupy B. Najczęściej używa się w tym celu różnych ras drożdży (Candida, Torula, Torulopsts). W suchej masie tych drożdży znajduje się około 55% białka, 7% tłuszczu, około 10% glikogenu oraz witaminy i inne substancje podnoszące wartość pokarmową paszy.

Chemizm

Fermentacja alkoholowa wywoływana przez drobnoustroje prowadzi do powstawania alkoholu i dwutlenku węgla z cukru prostego według równania:

C₆H₁₂O₆2C₂H₅CH + 2CO₂ + 117,2 x 10³j (28 kcal) fermentacja alkoholowa- strzałka

Kolejne stadia tej fermentacji aż do kwasu pirogronowego (organiczny związek z grupy keto kwasów- z grupą karboksylową i karbonylową występujący w naturze- jabłka, sfermentowane owoce), przebiegają podobnie jak przy fermentacji mlekowej, kwas pirogronowy pod wpływem karboksylazy zostaje rozłożony na aldehyd octowy i dwutlenek węgla. Aldehyd octowy po enzymatycznej redukcji jest zamieniany w al­kohol etylowy. Obliczając wydajność fermentacji alkoholowej można więc przyjąć, że z 1 g cukru powstaje 0,5 g alkoholu. Druga połowa cukru ulatnia się w postaci dwutlenku węgla. Wyrażając to równanie w ciężarach gramocząsteczkowych mamy;

180 g=2x46+2x44

(C₆H₁₂O₆)(2C₂H₅OH)+(2CO_Z)

Cały kompleks enzymatyczny katalizujący tę fermentację nazywa się zymazą. Zymaza działa wyłącznie na cukry proste, tj. na glukozę, fruk­tozę, mannozę, rzadziej galaktozę. Do fermentowania dwucukrów — sa­charozy lub maltozy - zdolne są tylko te drożdże, które oprócz zymazy zawierają enzymy hydrolityczne: maltazę lub sacharazę zwaną też inwertazą (enzym- hydrolaza, rozkładający sacharozę na glukozę i fruktozę). Jeżeli fermentacji poddaje się bardziej złożone węglowodany, np. skro­bię lub celulozę, wymagają one obróbki chemicznej lub biochemicznej w celu przeprowadzenia w formę podatną na fermentację. Na przykład, skrobia ziemniaczana przed fermentacją zostaje w gorzelniach scukrzona przy pomocy słodu, zawierającego enzymy amylolityczne (rozkładające- hydrolizujące skrobię).

Fermentacja octowa

Fermentacja octowa polega na tlenowym procesie przemiany etanolu na kwas octowy. Zdolność prowadzenia tego procesu ma stosunkowo licz­na grupa bakterii reprezentowana głównie przez rodzaj Acetobacter. Po­szczególne gatunki różnią się dość znacznie swymi właściwościami bio­chemicznymi. Naturalnym środowiskiem występowania bakterii octowych są przede wszystkim rośliny, a zwłaszcza fermentujące owoce. Można je również znaleźć w kwaśniejącym winie i piwie. Są to bakterie wybitnie tlenowe, dlatego często rozwijają się na powierzchni płynu w postaci kożuszka. Charakterystycznymi cechami bakterii fermentacji octowej są: pałeczkowaty kształt, brak przetrwalników oraz zdolność tworzenia form inwolu­cyjnych o bardzo zmienionych kształtach. Obserwuje się je naj­częściej w starych hodowlach pod wpływem zmian w środowisku, tj. w podwyższonej temperaturze, przy zwiększonym stężeniu alkoholu lub przy zakwaszeniu spowodowanym intensywną produkcją kwasu octowe­go. Niektóre bakterie octowe produkują znaczne ilości śluzu, którego głównym składnikiem chemicznym są wielocukry. Wywołuje to powsta­wanie zooglei (zlepieńce) i śluzowacenie fermentowanych płynów. Fermentacja octowa i wywołujące ją bakterie są rozpowszechnione w przyrodzie. W warunkach naturalnych fermentacja octowa przebiega spontanicznie w łańcuchu kolejnych reakcji wywoływanych przez drobno­ustroje współżyjące z sobą na prawach metabiozy. Umożliwia to wytwarzanie kwasu octowego z bardzo różnych prostych i złożonych węglowo­danów. Do technicznej produkcji octu w procesie fermentacyjnym używa się jednak wybranych i wyselekcjonowanych ras, uszlachetnianych po­dobnie jak drożdże. Pochodzą one najczęściej od gatunków Acetobacter schutzenbachii i A. curvum przystosowanych do wysokich stężeń alkoho­lu i intensywnego kwaszenia, co wiąże się z tolerancją tych ras na niski odczyn środowiska.

Chemizm

Utlenianie alkoholu etylowego do kwasu octowego można przedsta­wić sumarycznie równaniem:

CH₃CH₂OH + O₂CH₃COOH+H₂O+489,8 X10⁷J (117 kcal)

Wydajność reakcji wynosi od 87% do 90%. Pewne bowiem straty powoduje utlenianie się kwasu octowego wg reakcji:

CH₃COOH+20₂ 2C0₂+2H₂0

Przy fermentacji octowej wolny tlen zużywany jest na utlenienie wodoru wydzielającego się przy enzymatycznym rozkładzie uwodnionego aldehydu octowego w reakcji:

CH₃COH+H₂O CH₂COOH+H₂

Doświadczalnie wykazano, że wodór może być wiązany nie tylko przez wolny tlen, ale i przez inne substraty utleniające pochodzące z ze­wnątrz, np. błękit metylenowy. Praktycznie jednak fermentacja octowa zachodzi wyłącznie w warunkach tlenowych. Poza procesem właściwej fermentacji octowej często obserwuje się wytwarzanie kwasu octowego jako jednego z produktów heterofermentacji mlekowej, masłowej, tlenowych fermentacji pleśniowych i innych. Bakterie fermentacji octowej często występują jako szkodniki przy pro­dukcji piwa i wina oraz w gorzelniach i silosach (silos- budowla, lub część budowli przeznaczona do tymczasowego składania materiałów sypkich).

DROŻDŻE I GRZYBY STRZĘPKOWE

Kryteria podziału grzybów są różne; najprostszy opiera się na zróżnicowaniu ich wielkości - wyróżnia się grzyby makro- i mikroskopowe. Do pierwszych zalicza się grzyby kapeluszowe, drugie stanowią drobnoustroje mające duże znaczenie biotechnologiczne. Grzyby mikroskopowe dzieli się na drożdże (organizmy jednokomórkowe) oraz grzyby strzępkowe (grzyby nitkowate, mycelialne- plechowate (spolot strzępków grzybni), pleśnie) zdolne do tworzenia grzybni (plechy). Podział ten nie ma charakteru taksonomicznego, poza tym jest nieprecyzyjny, np. u drożdży można zaobserwować wzrost w postaci pseudogrzybni składającej się z połączonych pojedynczych komórek. Grzyby mikroskopowe odgrywają ważną rolę zarówno w przyrodzie, jak i znalazły szereg zastosowań prak­tycznych.

Drożdże

Drożdże są drobnoustrojami eukariotycznymi, znaleźć je można w glebie, wodzie, na owocach i warzywach. Drożdże są wykorzystywane w praktyce w takich dziedzinach przemysłu spożywczego jak winiarstwo, gorzelnictwo, browarnictwo i piekarnictwo, a także w przemyśle paszowym. Ponadto wykorzystano ich zdolności do fermentowania laktozy, wytwarzania białek z alkanów i odpadów papierniczych, produkcji glicerolu (gliceryna- najprostszy alkohol trójwodorotlenowy) i D-glucitolu (sorbitol, sorbit, alkohol heksahydroksylowy- słodka, bezbarwna krystaliczna substancja, dobrze rozpuszczalna w wodzie). Są one źródłem enzymów, np. β-D-fruktofuranozydazy (sacharaza, enzym powodujący rozkład sacharozy (dwucukru), β-D-galaktozydazy i lipazy. Drożdże zostały także zastosowane do wytwarzania nowych wiązań pomiędzy atomami węgla w związkach chemicznych, wytwarzania substancji chemicznych o ustalonej izomerii (różne związki chemiczne o tym samym wzorze sumarycznym)optycznej, pochodnych alkoholi drugorzędowych, stosowanych w syntezie produktów naturalnych oraz aktywnych biologicznie prostaglandyn (pochodna dziesieciowęglowych kwasów tłuszczowych działanie zbliżone do hormonów). Te ostatnie wytwarzane są na drodze inżynierii genetycznej przez Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe i Zygosaccharomyces bailii. Drożdże prezentowane w ramach ćwiczeń z mikrobiologii ogólnej zaliczane są do dwóch klas grzybów - Ascomycetes (workowce) i Deuteromycetes (grzyby niedoskonałe - Fungi imperfecti). Do pierwszej grupy zaliczane są grzyby zdolne do wytwarzania gamet płciowych i zarodników. Występują tu m. in. Saccharomyces cerevisiae i Pichia anomala (rodzina - Saccharo­mycetaceae, podrodzina - Saccharomycetoidae) oraz Schizosaccharomycetes pombe (rodzina - Saccharomycetaceae, podrodzina - Saccharomycetoidae). Do grzybów niedoskonałych zaliczamy gatunki niezdolne do wytwarzania zarodników: Rhodotarula graminis i Candida vini (rodzina Cryptococcaceae). Dotychczasowy rejestr drożdży obejmuje 4000 nazw. Trzeba jednak dodać, że ich klasyfikacja podlegała wielokrotnie zmianom w przeszłości. Obecna klasyfikacja koncentruje się przede wszystkim na opisie gatunków i szczepów i została ustalona na podstawie badań mikroskopowych, sposobu rozmnażania płciowego, wykorzystywania substratów odżywczych, badania wybranych właściwości biochemicznych oraz wyników hybrydyzacji DNA-DNA i DNA-RNA. W badaniach mikroskopowych zwraca się uwagę przede wszystkim na wielkość i kształt komórek, a także ich cykl rozwojowy. Szczególne znaczenie ma tutaj sposób tworzenia pączków (na jednym lub dwóch końcach komórek lub w dowolnym miejscu komórki), ewentualnie podział przez rozszczepianie, tworzenie wyrostków (filamentów), a także sposób powstawania askospor (zarodnik workowców, tworzony wewnątrz worka) i teleutospor (zarodniki zimowe powstające w złożonym cyklu rozwojowym podstawczaków), (jeżeli powstają). Niektóre drożdże mogą rozmnażać się przez wytwarzanie podstawek. Bada się również zdolność drożdży do fermentowania cukrów, możliwość wzrostu w hodowlach napowietrzanych - na podłożach zawierających różne źródła węgla i azotu („test asymilacyjny") oraz zdolność do wzrostu na podłożach nie zawierających witamin. Ponadto sprawdza się możliwość hodowli tych drobnoustrojów na podłożach zawierających 50% lub 60% D-glukozy oraz na podłożach, w których obecna jest D-glukoza (5%) i 10% NaCl. Zwraca się też uwagę na ewentualną zdolność wzrostu tych mikroorganizmów w temperaturze 37°C, stopień wzrostu na podłożach z aktidionem (aktydion?), wytwarzanie skrobiopochodnych polisacharydów, właściwości lipolityczne (niszczący lipidy- tłuszcze), oraz wytwarzanie kwasów organicznych podczas wzrostu. Przy klasyfikacji drożdży uwzględnia się również budowę ściany komórkowej oraz rodzaj ubichinonu (przenośnik elektronów, benzochinon), występującego w ich komórkach (Q₆ Q₁₀). W ostatnim wydaniu przewodnika do oznaczania drożdży przedstawiono opis 590 gatunków drożdży wraz ze szczegółowymi danymi o cechach, które uwzględniono przy ich klasyfikacji. Poniżej, jako przykład zaprezentowany zostanie skrócony przegląd danych dla Saccharomyces cerevisiae. Gatunek ten został opisany po raz pierwszy przez Meyene'a i Hausena. W przewodniku podaje się wszystkie synonimy, jakimi posługiwano się, określając ten gatunek w przeszłości (ponad 100 nazw). Charakterystyka makro- i mikroskopowa tych drożdży przedstawia się następująco: wzrost w postaci kolonii biało-kremowych, o konsystencji mazistej; zdolności do pączkowania; brak zdolności do tworzenia wyrostków; wytwarzanie (na podłożu Mc Clary, zawierającym octan potasu) worków, z gładkimi, owalnymi lub okrągłymi askosporami w liczbie 1-12. Wyniki badań fi­zjologicznych i właściwości biochemicznych S.cerevisiae obejmują zdolność do fermentacji (lub jej brak) 14 cukrów, wzrostu na 44 źródłach węgla, 9 źródłach azotu, wykorzystywanie witamin (10 różnych zamów), zdolność do wzrostu w temperaturze 25, 30, 35, 37 i 40^CC oraz możliwość (lub brak) hodowli na podłożu z aktidionem (0,1 i 1%), 1% kwasem octowym, a także glukozą w stężeniu 50 i 60%. Dane te uzupełniono wynikami badań zdolności do wytwarzania skrobi (brak), kwasu octowego (brak), hydrolizy mocznika (brak) oraz wynikami testu DBB (Diazonium blue B test; reakcja aminokwasów aromatycznych w białkach drożdży z barwnikiem DBB - wynik dodatni ciemnoczerwona barwa hodowli, pojawiająca się w ciągu 2 minut) - dla S.cerevisiae wynik ujemny. Obok tych danych zamieszczono wartość % Mol. G + C DNA jądrowego, wykaz źródeł izolacji ze środowiska naturalnego oraz wyniki hybrydyzacji z DNA i RNA innych gatunków drożdży. Z danymi tymi studenci zostaną zapoznani podczas zajęć praktycznych.

Przedstawione wyżej kryteria podziału drożdży oraz przyjęta systematyka uwzględnia zasady nomenklatury botanicznej. Powyższy podział nie ma jednak większego znaczenia praktycznego. Z utylitarnego punktu widzenia drożdże dzielimy na tzw. dzikie (np. C. vini) oraz tzw. szlachetne (np. S. cerevisiae). Drożdże dzikie są niepożądane, gdyż powodują „psucie się" produktów spożywczych, owoców (C. vini tworzy tzw. „kwiat winny" obniżający jakość wina). Drożdże szlachetne znalazły zastosowanie w wyżej wymienionych gałęziach przemysłu i dzielimy je na drożdże fermentacji górnej i dolnej. Drożdże fermentacji górnej wykorzystują rafinozę tylko w 1/3 rozkładając ją do melibiozy i fruktozy, którą fermentują. Drożdże fermentacji dolnej wykazują zdolność do fermentacji zarówno fruktozy, jak i melibiozy (dwucukier galaktoza + glukoza). Po skończeniu procesu fermentacji drożdże fermentacji dolnej tworzą konglomeraty (całość, zlepek części) i opadają na dno naczynia, w odróżnieniu od drożdży fermentacji górnej, które pozostają w płynie. Drożdże hodujemy na brzeczce - podłożu płynnym lub zestalonym agarem, moszczach (surowy sok owocowy), sokach owocowych i innych podłożach. Sposób jej przygotowania przedstawiono poniżej.

Brzeczka

Jest to podłoże powszechnie stosowane do hodowli drożdży, pleśni oraz bakterii amylolitycznych (rozkład skrobi na cukry proste). Przygotowuje się ją z suchego drobno zmielonego słodu browarniczego. Słód otrzymuje się przez poddanie kiełkowaniu na­moczonych ziaren wysokiej jakości oczyszczonego jęczmienia. W czasie słodowania jęczmień poddaje się napowietrzaniu; w jego ziarnach zwiększa się znacznie zawartość enzymów proteolitycznych i amylolitycznych. Po zakończeniu tego procesu słód rozdrabnia się, a następnie zaciera w kadzi zaciernej przez dodawanie wody ogrzanej do temperatury 4S°C. W czasie tego procesu następuje częściowa enzymatyczne hydroliza białek, a po podniesieniu temperatury do 63°C rozpoczyna się etap scukrzania skrobi przy udziale amylaz. Efektywność tego scukrzania bada się sprawdzając barwliwość próbek z płynem Lugola (Jean Guillaume Auguste Lugol- francuski lekarz, leczący wole- powiększoną tarczycę płynem Lugola- jodkiem potasu, jodem). Słód najczęściej zostaje scukrzony w ciągu 11/2 godziny. Po tym czasie całość filtruje się, uzyskując brzeczkę - pełnowartościowe podłoże będące źródłem węgla, azotu, soli mineralnych i czynników wzrostowych. W dużej ilości występują w nim przede wszystkim cukry (maltoza, glukoza, maltotrioza), oligopeptydy i aminokwasy oraz witaminy z grupy B.

Budowa komórki drożdżowej

Komórki drożdży mają przeważnie kształt kulisty, elipsoidalny, jajowaty lub wydłużony. Drożdże o odmiennych kształtach komórek są spotykane rzadko. Wprawdzie kształt komórki zależy od gatunku drożdży, jednak nie zawsze cechę tę można wykorzystać do ich rozpoznawania z uwagi na małe różnice między gatunkami. Kształt komórki danego gatunku zależy ponadto od warunków i wieku hodowli. Komórki młode charakteryzują się bardziej jednolitym kształtem, starsze są bardziej zróżnicowane pod względem kształtu i wielkości. W hodowlach starych można znaleźć komórki odbiegające w znacznym stopniu od komórek typowych, występujących w hodowlach młodych i dojrzałych. Wielkość komórek drożdżowych waha się, zależnie od gatunku i sposobu odżywiania, od 1 do- 5 μm średnicy i od 1 do 10 μm długości dla komórek odpowiednio okrągłych i wydłużonych. W dojrzałej komórce drożdżowej wyróżniamy ścianę komórkową, błonę cytoplazmatyczną, jądro komórkowe, rybosomy, mitochondria, aparat Golgiego (Camillo Golgi włoski lekarz, histolog, aparat Golgiego- redukuje azotany, srebro- chemiczne modyfikacje substancji zużywanych przez komórkę), wodniczki, oraz materiały zapasowe. Ściana komórkowa drożdży pączkujących z rodzaju Saccharomyces oraz Candida charakteryzuje się jednolitą strukturą chemiczną. Odbiega ona składem chemicznym oraz organizacją budowy od ściany komórkowej większości grzybów oraz bakterii; w jej skład wchodzą przede wszystkim homopolimery (ze związków o małej masie cząsteczkowej powstają związki o większej masie cząsteczkowej) - glukany i mannany, uzupełnione niewielkimi ilościami chityny i białka (zbudowane z aminokwasów). Te ostatnie są częścią glikoproteidów (białko złożone) występujących w ścianie - głównie manno protein (białko-białko). Chityna zaś stano i fragment sztywny, szkieletowy ściany komórkowej drożdży - jest to polimer N-acetylo-D-glukozaminy (aminocukry, pochodne glukozy). W komórkach drożdży występuje α-chityna (wytwarzana przez nabłonek, wielocukier o strukturze podobnej do celulozy). Główną część ściany komórkowej drożdży stanowią mannoproteidy (proteidy- białka złożone, mannoza- cukier prosty z grupy aldoz i heksoz) w skład których wchodzą dwa rodzaje polimerów mannozowych połączonych kowalencyjnie (różnica elektroujemności 0) z białkami ściany. W wysokocząsteczkowym mannanie wyróżniamy łańcuch zewnętrzny zbudowany z 100-150 podjednostek oraz część rdzeniową, związaną przez dwie reszty GlcNAc z asparagina białka. Niskocząsteczkowy oligomannan (mało-cukier) składa się z krótkich łańcuchów zbudowanych z reszt mannozylowych przyłączonych do seryny lub treoniny białka. Intensywne badania poszczególnych ele­mentów ściany komórkowej drożdży i wzajemnego ich ułożenia dopro­wadziło do opracowania schematu architektury tej części komórki. Część sztywna ściany komórki drożdży tworzą glukany z domieszką chityny. Determinują one kształt komórki i zabezpieczają przed uszkodzeniami mechanicznymi, a także zapobiegają lizie komórki w środowisku hipotonicznym (stężenie większe niż wewnątrz komórki). W ścianie komórkowej występuje wiele enzymów, odpowiedzialnych nie tylko za jej syntezę, ale także warunkujących inne właściwości. Man­noproteidy tworzą fragment zewnętrzny ściany - ich część cukrowa nadaje komórce swoistość immunologiczną (zidentyfikowano co najmniej sześć epitopów odpowiedzialnych za reakcje ze swoistymi przeciwciałami), a białka, które również spełniają rolę antygenów (termolabilnych TLAa i TLA_b, odgrywają, najprawdopodobniej, ważną rolę w zachowaniu integralności całej struktury ściany komórkowej, są też receptorami swoistymi dla feromonów płciowych i toksyn. Ważną funkcję w komórce spełnia również wodniczka, zawierająca przede wszystkim enzymy hydrolizujące glikoproteidy. W młodej komórce wodniczki mogą nie występować lub są bardzo małe, w komórkach starszych powiększają się, a czasem zlewają w jedną dużą wodniczkę wypełniającą prawie całą komórkę. Drożdże, zależnie od gatunku i warunków środowiskowych, mogą gromadzić substancje zapasowe - glikogen (skrobia zwierzęca, polisacharyd, węglowodan, glukoza połączona wiązaniem glikozydowym), tłuszcze i wolutynę (substancja zapasowa bakterii, znajduje się w cytoplazmie, polimer fosforanowy służący do syntezy ATP). Glikogen - rezerwa cukrowa - odkładany jest w postaci ziaren, które można uwidocznić w komórce po potraktowaniu jej płynem Lugola - glikogen barwi się na kolor brunatno-czerwony, cytoplazma zaś na kolor jasnożółty. Tłuszcze wykrywamy posługując się barwnikiem Sudan III (do barwienia lipidów)- zabarwiają się na kolor ceglastoczerwony. Wolutynę (polifosforany) identyfikujemy po potraktowaniu komórki błękitem toluidynowym (do barwienia komórkowego).

Rozmnażanie się drożdży

Drożdże rozmnażają się wegetatywnie przez pączkowanie (większość) oraz drogą fragmentacji przez tzw. rozszczepianie (Schizosaccharomyces ssp.). Wyróżniamy trzy typy pączkowania: kubeczkowate, bliznowe oraz annellidowe (annelida- pierścienice). Pierwszy sposób jest charakterystyczny dla tzw. nibydrożdży i nie będzie tu omawiany. Drugi przejawia większość drożdży (S. cerevisiae- gatunki winiarskie, piwowarskie, gorzelnicze i piekarnicze). Pączkowanie odbywa się zależnie od gatunku albo w dowolnym miejscu owalnej komórki macierzystej, albo w określonym jej miejscu, np. w przypadku komórek wydłużonych pączek z reguły powstaje na jej zakończeniach. Pierwszym etapem tego procesu jest uwypuklenie się komórki macierzystej. Uwypuklenie to powiększa się w pączek, który po okresie dalszego wzrostu i dojrzewania oddziela się od komórki ścianą. Na obydwu komórkach, macierzystej i potomnej, pozostają tzw. blizny. Każde następne pączkowanie odbywa się w innym miejscu ściany. Na podstawie liczby blizn można ocenić względny wiek komórek pączkujących. Liczba blizn może sięgać do 40. Podczas rozrastania się powstałego pączka rozpoczyna się tworzenie pączka następnego. Pączkowanie wg typu annellidowego jest charakterystyczne dla tzw. drożdży apikularnych tj. wydłużonych (np. Saccharomycodes ludwigii)- Pączkowanie ogranicza się tylko do dwóch biegunów (tzw. pączkowanie bipolarne) i następuje na przemian na jednym i na drugim biegunie. U Candida vini nie oddzielające się pączki powstają również na końcach komórek. W następstwie takiego rozmnażania możemy obserwować w hodowli połączone ze sobą komórki, przypominające gałązki, łańcuszki, co nazywamy pseudogrzybnią. Przyleganie komórek w takich skupiskach ułatwia wydzielany śluz powierzchniowy. Obok rozmnażania wegetatywnego drożdże właściwe, zaliczane do workowców, rozmnażają się na drodze płciowej. Wyróżniamy trzy rodzaje tego rozmnażania - cykl haplobiontyczny, haplo-diplobiontyczny i diplobiontyczny. Cykl haplobiontyczny, charakterystyczny dla Octosporomyces octosporus, przebiega w haplofazie. Haploidalne komórki drożdży układają się parami obok siebie, kopulują i po zlaniu się ich jąder zespalają się. Jądro zygoty dzieli się mejotycznie, co prowadzi do powstania ośmiu askospor, które po uwolnieniu z worka przekształcają się w komórki macierzyste. Cykl haplo-diplobiontyczny wykryty u S. cerevisiae jest bardziej złożony. Najpierw pączkują komórki haploidalne, które następnie kopulują, dając diploidalne zygoty. Te ostatnie również pączkują, a wiec w środowisku występują łącznie obok siebie wegetatywne komórki pączkujące haplo- i diploidalne, Z komórek diploidalnych w warunkach szczególnych (patrz niżej) wykształcają się worki z zarodnikami. Cykl diplobiontyczny jest właściwy dla S. ludwigii. W jego przebiegu dochodzi do kopulacji askospor, najczęściej wewnątrz worka. Dalsze etapy cyklu odbywają się więc w formie diploidalnej. Tworzenie zarodników jest nie tylko jednym ze sposobów rozmnażania się, ale także możliwością przeżycia komórek w warunkach niesprzyjających (brak lub niewielka ilość substancji odżywczych, niska temperatura, wysuszenie środowiska). Drożdże dzikie łatwiej pączkują, szczepy laboratoryjne należy pobudzić do wytwarzania zarodników np. przez posiew na bloczki gipsowe, skrawki marchwi lub odżywcze podłoża minimalne (podłoże Mc Clary - podłoże agarowe zawierające octan potasu). Kształt, liczba i ułożenie zarodników w worku może być cechą diagnostyczną. Zarodniki są bardziej oporne na czynniki zewnętrzne niż komórki wegetatywne, z których pochodzą.

Metabolizm drożdży i ich zastosowanie praktyczne

Drożdże są w zasadzie tlenowcami, chociaż mogą również rosnąć w warun­kach beztlenowych, wtedy prowadzą proces fermentacji etanolowej. Gatunkiem wykorzystywanym do tego celu jest S.cerevisiae. W gorzelnictwie stosowane są szczepy (rasy) termofilne, rozmnażające się w temperaturze 33-37°C, o dużej trwałości fizjologicznej podczas fermentacji, którą prowadzą w warunkach przemysłowych w czasie od 1 do 3 dób. Inne rasy drożdży stosuje się w winiarstwie (np. Tokay, Malaga, Steinberg wina) i browarnictwie. Do procesów fermentacji S.cerevisiae wykorzystuje cukry proste- glukozę, galaktozę, fruktozę, sacharozę (glukoza-fruktoza), maltozę (dwucukier, dwie cząstki glukozy), maltotriozę i ksylozę (cukier drzewny, węglowodan, monosacharyd, składnik hemiceluloz. Drożdże zaliczane do Kluyveromyces marxianus fermentują również laktozę i są wykorzystywane do produkcji etanolu z serwatki, która jest uciążliwym ściekiem zanieczysz­czającym środowisko naturalne.

Wydajność procesu fermentacji alkoholowej zależy od oporności drożdży na etanol. Drożdże S.cerevisiae mogą rosnąć przy stężeniu etanolu 120 g/l, a proces fermentacji prowadzą przy stężeniu tego alkoholu 180 g/l. Etanol działa denaturujące na białka enzymatyczne i strukturalne, błonę komórkową, mitochondrialną i jądrową oraz retikulum endoplazmatyczne. Fermentacja etanolowa zachodząca przy udziale drożdży jest hamowana przez tlen (efekt Pasteura). Mechanizm tego oddziaływania polega na represji i hamowaniu aktywności enzymów drogi EMP w obecności tlenu (m.in. fosfofruktokinazy, aldolazy oraz kinazy pirogronianowej). Jednakże śladowe ilości tlenu w śro­dowisku fermentacji są korzystne dla wydajności tego procesu (odwrotny efekt Pasteura). Obecność tlenu w środowisku zwiększa oporność drożdży na wysokie stężenie etanolu, ponadto jest niezbędna do syntezy kwasu nikotynowego (pochodna pirydyny, bezbarwna substancja słabo rozpuszczalna w wodzie)i NAD, steroli i nienasyconych kwasów tłuszczowych. Z kolei wysokie stężenie glukozy (powyżej 1-2 g/1) hamuje oddychanie tlenowe komórek (efekt Crabtree), wzmagając glikolizę, ograniczając zaś szlak HMP i cykl Krebsa. Procesowi fermentacji prowadzonej przez drożdże sprzyja też duża szybkość wzrost tych drobnoustrojów w hodowli. Drożdże wykorzystują również zdolność do wzrostu w warunkach mikroaerofilnych oraz w hodowlach aerowanych i wykorzystują wtedy cykl Krebsa oraz tlen jako ostateczny akceptor elektronów i protonów w procesach oddychania. Hodowle napowietrzane stosuje się do namnażania drożdży piekarniczych (S.cerevisiae). Bardzo często namnaża się 3-4 rasy drożdży równocześnie, stosując hodowle melasowe, intensywnie aerowane. Drożdże stosowane w przemyśle piekarniczym, wydzielając CO₂, powodują spulchnianie ciasta, a nadto są źródłem witamin oraz makro- i mikroelementów. Ponieważ białko drożdży ma wartość pośrednią pomiędzy białkiem roślinnym i zwierzęcym, zostały one wykorzystane jako dodatek do pasz dla zwierząt. Drożdże paszowe winny zawierać co najmniej 50% białka w suchej masie i szybko się rozmnażać. Jako drożdże paszowe wykorzystuje się gatunki z rodzajów Torulopsis i Candida. Charakteryzują się zdolnością przyswajania m. in. gliceryny, kwasów organicznych, pentoz oraz cukrów nie ulegających fermentacji. Substancje te drożdże „zamieniają" na biomasę.

Drożdże i pleśnie są naturalnymi składnikami mikroflory roślin. Ograniczony rozwój drożdży może być w kiszonce nawet pożądany, gdyż produkują one alkohol zaostrzający smak kiszonki oraz różne witaminy i substancje wzrostowe potrzebne bakteriom kwasu mlekowego i podno­szące wartość pokarmową kiszonek. Zbyt silne namnożenie się drożdży w kiszonce może stanowić niebezpieczną konkurencją dla bakterii mleko­wych. Poza tym drożdże mogą wykorzystywać kwasy organiczne, jako źródło węgla i energii. Liczniejsze pojawianie się drożdży w kiszon­kach jest zwykle oznaką ich starzenia się. Pleśnie natomiast są bezwzględ­nymi szkodnikami w kiszonkach. Są to organizmy wybitnie tlenowe, ata­kują wiać kiszonki od warstw wierzchnich, rozprzestrzeniając się jednak coraz głąbiej. Wytwarzają one z reguły enzymy proteolityczne, wywołu­jąc rozkład białek z wytworzeniem niepożądanych produktów. Poza tym jako materiał energetyczny mogą wykorzystywać kwasy organiczne, roz­kładając je i obniżając w ten sposób zakwaszenie środowiska. Stwarza to warunki do wtórnego rozwoju bakterii gnilnych i bakterii fermentacji masłowej.

9

---