ENZYMY EKSTREMALNYCH PSYCHOFILI

Psychrofile

-W najszerszym rozumieniu są to organizmy, które żyją w zimnych środowiskach.

- Są to organizmy, które optymalny wzrost wykazują w temperaturze niższej niż 15˚C i nie rosną w temperaturze powyżej 20˚C. Są zdolne do wzrostu w temperaturze 0˚C lub niższej. Niektóre są w stanie przetrwać nawet w -60˚C.

- Termin ten stosuje się przede wszystkim w odniesieniu do mikroorganizmów, jednak wielu autorów do organizmów psychrofilnych zalicza poza prokariotami i drożdżami także niektóre algi, owady, ryby oraz rośliny pod warunkiem, że są one stale pod wpływem niskiej temperatury (poniżej 5˚C).

Psychrofile, psychrotrofy czy psychrotoleranty?

- W przypadku mikroorganizmów zachodzi potrzeba rozróżnienia tych, które są w stanie żyd w niskich temperaturach (mimo wysokiego optimum) od prawdziwych psychrofili. I tak:

- Psychrofile (psychrofile obligatoryjne) - optimum wzrostu <15˚C, maksimum 20˚C,

- Psychrotrofy (psychrofile fakultatywne) - mogą żyd w temperaturze ponad 20˚C, ale jednocześnie są zdolne do podziałów w temperaturze bliskiej 0C, preferują środowiska zimne, jednak mają szeroki zakres tolerancji

- Psychrotoleranty - mezofile, które mogą przystosować się do niskich temperatur

Środowisko życia

- Psychrofile występują w wiecznie zimnych środowiskach takich jak: wody słodkie i morskie, lodowce i lód morski, śniegi, polarne i wysokogórskie gleby, zimne pustynie oraz wieczne zmarzliny. Dominują tam one liczebnie i funkcjonalnie.

- W środowiskach nie permanentnie zimnych mogą dominować pod warunkiem, że dostarczona jest dostateczna ilość materii organicznej, co pozwoli im na szybką reprodukcję w krótkim czasie.

Lód:

- Lód wiecznej zmarzliny, lodowce, lód morski i jeziorny, śnieg

- Mikroorganizmy mogą w nim żyd dzięki temu, że między kryształkami lodu znajdują się przestrzenie z wodą w stanie płynnym. Dzieje się tak pod warunkiem, że temperatura nie jest zbyt niska (powyżej -5˚C dla lodowców, powyżej -35˚C dla lodu morskiego, różnica wynika z faktu zasolenia).

W kanalikach lodu występują:

-Cyanobacteria i niektóre glony (odpowiedzialne za produkcję materii organicznej)

- bakterie heterotroficzne z rodzajów: Octadecabacter, Alteromonas, Colwellia, Glaciecola, Pseudoalteromonas, Shewanella, Cytophaga, Flavobacterium, Gelidibacter, Polaribacter.

Wieczna zmarzlina (permafrost):

- Obejmuje 26% powierzchni gleb od 0,5m do ponad 1450m w głąb

- Są to gleby, których temperatura przez cały czas jest poniżej 0˚C.

- Występują w niej psychrofile takie jak: Psychrobacter fozii, Psychrobacter maritimus, Deinococcus radiomollis, D. claudionis, D. altitudinis, D. alpinitundrae.

Głębiny oceanów:

- Wody poniżej 1000m pokrywają 60% powierzchni Ziemi.

- Są to środowiska skrajne, temperatura wynosi 2-4˚C, a ciśnienie dochodzi do 110MPa, woda jest słona, panuje ciemnośd, a substancje pokarmowe występują w skrajnie niskich stężeniu.

- W warunkach takich występują psychrofile z rodzajów: Colwellia, Moritella, Photobacterium, Psychromonas, Shewanella.

Szczególne adaptacje psychrofili do środowiska

- Psychrofile osiągnęły fizjologiczny i ekologiczny sukces w zimnych środowiskach przede wszystkim dzięki unikalnym cechom ich białek i błon.

- Adaptacje do zimna składają się z wielu przystosowań na poziomach:

• biochemicznym (kinetyka enzymów, synteza wyspecjalizowanych cząsteczek)

• ponadcząsteczkowym i subkomórkowym (regulacja płynności błon komórkowych, kanały jonowe)

• fizjologicznym (szlaki metaboliczne, sezonowe obniżenie czynności życiowych)

Największym problemem, z którym muszą się zmierzyć organizmy żyjące w ekstremalnie zimnych środowiskach jest zamarzanie wody wewnątrzkomórkowej.

Czysta woda zamarza w temperaturze 0˚C, woda morska zaś średnio w temperaturze od -0,5 do -0,9˚C. Zależy to od stężenia soli, głównego czynnika odpowiedzialnego za obniżenie temperatury krzepnięcia wody.

Białka histerezy termicznej (thermal histeresis proteins)

- Organizmy psychrofilne rozwiązały problem zamarzania wody wewnątrzkomórkowej poprzez syntezę specjalnych glikoprotein i peptydów, które mogą obniżyd jeszcze bardziej temperaturę jej krzepnięcia.

- Inne nazwy tych białek to antifreeze proteins (AFPs) lub ice structuring proteins (ISPs).

Błony

- Zawierają specyficzne białkowe składniki, zapewniające im płynnośd oraz możliwośd transportu substratów w ekstremalnie zimnych warunkach.

Enzymy

- Enzymy to wielkocząsteczkowe, w większości białkowe katalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne.

- Enzymy nie zmieniają stanu równowagi reakcji chemicznej, a jedynie przyspieszają jego ustalenie. Następuje to wskutek obniżenia energii aktywacji (ΔG*) reakcji.

Wpływ niskiej temperatury na enzymy mezofilne

- Szybkośd reakcji chemicznej jest tym wyższa im wyższa jest temperatura (T) i im niższa jest wartośd energii aktywacji (ΔG*), co wynika z równania:

• gdzie:

k - stała szybkości reakcji,

қ - współczynnik transmisji,

K_B - stała Bolzmanna (1,38⋅10^-23 J⋅K^-1),

h - stała Plancka (6,63⋅10^-34 J⋅s^-1),

R - stała gazowa (8,31 J⋅K^-1⋅mol^-1),

T - temperatura w Kelwinach,

ΔG* - energia aktywacji.

- Szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta wraz ze wzrostem temperatury. Wiąże się to z podwyższeniem energii kinetycznej cząstek i większą częstotliwością ich zderzeń.

- Wielkość wzrostu aktywności enzymatycznej w zależności od temperatury opisuje współczynnik temperaturowy Q10, określający jak zmieni się szybkość reakcji przy wzroście temperatury o 10 °C:

• Spadek temperatury powoduje spadek szybkości reakcji.

-Większość systemów biologicznych wykazuje spadek szybkości reakcji 2-3 razy gdy temperatura zostanie obniżona o 10˚C (Q10 = 2 do 3).

- W konsekwencji, gdy temperatura reakcji zostanie zamieniona z 37˚C do 0˚C, aktywność enzymu mezofilnego jest od 16 do 81 razy niższa (2⁴ do 3⁴).

- W związku z tym zaskakuje fakt, iż czas generacji (okres czasu potrzebny do podwojenia się liczby komórek) bakterii pschrofilnych w temperaturze bliskiej 0˚C jest tego samego rzędu, co czas generacji mezofili w 37˚C.

Aktywnośd i adaptacje strukturalne enzymów psychrofili

- W badaniach wykazano, że enzymy psychrofilne odznaczają się wyższą reaktywnością (k_kat) i wyższą wydajnością (k_kat/K_m) niż ich mezofilne i termofilne odpowiedniki.

• k_kat/K_m - odzwierciedla zarówno powinowactwo chemiczne, jak i zdolnośd katalityczną enzymu. Stosunek ten jest używany do porównywania różnych enzymów względem siebie lub preferencji jednego enzymu do różnych substratów

• k_kat - stała katalityczna, wyraża liczbowo zdolność enzymu do katalizowania reakcji chemicznych (jego reaktywność), szybkość tworzenia produktu

-Taka poprawa katalitycznych parametrów wywodzi się prawdopodobnie z wysoko elastycznej struktury białek, która zapewnia lepsze zdolności przechodzenia zmian konformacyjnych podczas katalizy w niskich temperaturach.

- Jednakże struktura trójwymiarowa enzymów psychrofilnych bardzo często nie różni się znacznie od mezofilnych i termofilnych odpowiedników.

-Zwiększona elasycznośd enzymów przystosowanych do zimnego środowiska może wynikad z:

• zmian w wiązaniach wewnątrz cząsteczkowych

• interakcji z rozpuszczalnikiem (wodą i rozpuszczonymi jonami)

• interakcji między podjednostkami

• zwartości rdzenia

• wielkości i rozdzielenia wgłębieo

W stosunku do enzmów mezofilnych, psychrofilne mają:

• więcej polarnych i mniej hydrofobowych reszt aminokwasowych,

• więcej glicyny

• niższy stosunek zawartości argininy do lizyny

• mniej wiązań wodorowych, oddziaływań aromatycznych i wiązań jonowych

• brak mostków solnych

• dodatkowe miejsca z podwyższoną zawartością polarnych reszt aminokwasowych lub/i obniżoną zawartością proliny

• zmodyfikowane oddziaływania dipolowe w α-helisach

• zredukowane oddziaływania hydrofobowe pomiędzy podjednostkami

-Cechy te nigdy nie występują wszystkie naraz w jednym enzymie. Każdy ma swój specyficzny zestaw zmian w stosunku do mezo- i termofilnych analogów.

- Nadają one elastyczność centrom aktywnym enzymów, jednak kosztem aktywności w wyższych temperaturach.

- To właśnie powoduje termolabilność, czyli termiczną niestabilność, enzymów aktywnych w skrajnie niskich temperaturach, chod są od tej reguły pewne wyjątki.

Przykłady enzymów psychrofili

- Dehydrogenaza mleczanowa z Bacillus psychrosaccharolyticus

• Oksydoreduktaza katalizująca reakcję przemiany: kwas pirogronowy <-> kwas mlekowy.

• Jest to pierwszy enzym psychrofilny, którego gen został sklonowany i porównany do homologicznych sekwencji z bakterii mezofilnych i termofilnych.

• Badania wykazały, że dehydrogenaza mleczanowa psychrofilna zawiera więcej polarnych reszt aminokwasowych, a mniej hydrofobowych niż jej odpowiedniki. Powoduje to zwiększenie elastyczności enzymu.

Syntaza cytrynianowa (EC 2.3.3.1) z Arthrobacter sp. DS2-3R

- Enzym cyklu Krebsa, transferaza katalizująca reakcję włączania acetylo-CoA do cyklu.

- Została wyizolowana z wielu psychrofilnych i psychrotolerancyjnych bakterii antarktycznych. Optima wzrostu tych bakterii zawierają się w przedziale 17-45C, mimo to wszystkie zdolne są do wzrostu w temperaturze bliskiej 0C.

- Gen syntazy cytrynianowej z Arthrobacter sp. DS2-3R został sklonowany i zsekwencjonowany.

- Struktura tego psychrofilnego enzymu została porównana ze strukturą homologicznych enzymów z mezofila Mycobacterium smegmatis, termofilnego archeona Thermoplasma acidophilum i hipertermofilnego archeona Pyrococcus furiosus.

α-Amylaza (EC 3.2.1.1) z Alteromonas haloplanctis

- Hydrolaza, katalizująca reakcję endohydrolizy wiązania -(1-4)glikozydowego w oligosacharydach i polisacharydach.

- Jest to pierwszy psychrofilny enzym, który został wykrystalizowany, a jego struktura porównana za pomocą rentgenografii strukturalnej (stworzenie modelu przestrzennego) z -amylazą świni.

- Badania wykazały, że enzym psychrofilny wykazuje optimum działania w temperaturze około 30˚C niższej niż enzym mezofilny (świoski). Ponadto, w temperaturach 4˚C i 25˚C wykazał on wydajność katalityczną (k_kat/K_m) odpowiednio 6,6 i 3,7 razy wyższą.

Izomeraza triozofosfornanowa (EC 5.3.1.1) z Vibrio marinus

- Enzym glikolizy, izomeraza katalizująca reakcję: fosfodihydroksyaceton (DHAP) <-> D-aldehyd 3-fosfoglicerynowy (PGAL).

- Różnica między tym psychrofilnym enzymem, a jego mezofilnym odpowiednikiem polega jedynie na zastąpieniu seryny w pozycji 238 alaniną.

- Już tak mała zmiana powoduje, że izomeraza triozofosforanowa z Vibrio marinus jest wysoko wydajna katalitycznie, a jednocześnie bardzo niestabilna termicznie (jej czas półtrwania w 25˚C wynosi jedynie 10min).

Dehydrogenaza jabłczanowa (EC 1.1.1.37) z Aquaspirillum arcticum

- Oksydoreduktaza ostatniej reakcji cyklu Krebsa: jabłczan -> szczawiooctan +NADH).

- Enzym ten wykazuje wysoką wydajnośd katalityczną w niskich temperaturach. Co ciekawe, w temperaturze 37˚C jest wciąż bardziej wydajny (1,25x) niż jego mezofilny odpowiednik z E. coli.

Potencjalne zastosowanie enzymów psychrofili

- Degradacja materiału antropogennego w zimnym środowisku, bioremediacja, np. oleju napędowego, polichlorowanych bifenyli (zawarte są w transformatorach, kondensatorach, impregnatach, płynach hydraulicznych, smarach, opakowaniach, farbach drukarskich, preparatach owadobójczych, klejach, tworzywach sztucznych)

- Przetwórstwo żywności (fermentacja, serowarstwo, piekarnictwo, cukiernictwo, kruszenie mięsa)

- Środki czyszczące

- Obróbka skór

- Przemysł tekstylny

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFAs - polyunsaturated fatty acids)

-Należą do nich kwasy omega-3, omega-6 i omega-9.

- Kwasy tłuszczowe omega-3 i omega-6 to tzw. kwasy niezbędne, które muszą być dostarczane do organizmu wraz z pożywieniem.

- Tradycyjnym źródłem tych kwasów są ryby (a także w mniejszym stopniu algi).

- Badania wykazały, że istnieje całkiem sporo rodzajów bakterii, występujących w głębinach oceanicznych, które je produkują.

- Prowadzi się badania nad produkcją wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na skalę przemysłową przez organizmy prokariotyczne.

---