-1-

ĆWICZENIE 4 czwartek/piątek

1. Dezynfekcja rąk mieszaniną środka dezynfekcyjnego i związku o działaniu fluorescencyjnym oraz kontrola dezynfekcji pod lampą

2. Oznaczanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej preparatu dezynfekcyjnego STERINOL metodami rozcieńczenia = neutralizacji oraz sączenia przez filtr membranowy:

1. Walidacja metod:

• walidacja wybranych warunków badania,

• walidacja toksyczności neutralizatora,

• walidacja metody rozcieńczania - neutralizacji

• walidacja procedury sączenia

UWAGA 1.

Każda grupa wykonuje oznaczenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej preparatu Sterinol zgodnie z normą w trzech różnych stężeniach

Trzy odpowiednio rozcieńczone preparaty STERINOL znajdują się w każdej grupie asystenckiej.

UWAGA 2.

- do oznaczeń właściwych należy używać zawiesiny zawierającej od 1.5x10⁸ do 5.0x10⁸ cfu/ml

- do oznaczeń walidacyjnych należy używać zawiesiny zawierającej od 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/

Dlatego przed rozpoczęciem oznaczeń należy sporządzić odpowiednie zawiesiny szczepu testowego. Każda grupa używa innego szczepu testowego. Do przygotowania zawiesiny szczepu testowego o określonej gęstości do dyspozycji studentów jest densytometr.

Aby znać dokładnie liczbę drobnoustrojów w przygotowanej zawiesinie należy wykonać seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia:

1. do 7 probówek wlać po 4.5ml soli fizjologicznej,

2. do pierwszej probówki dodać 0.5 ml szczepu testowego,

a następnie wykonać seryjne 10- krotne rozcieńczenia przenosząc po 0.5ml mieszaniny do następnej probówki.

3. z 7 probówki pobrać dwie próbki po 1.0 ml mieszaniny

i przenieść do dwóch pustych jałowych płytek, które następnie zalewa się podłożem TSA-AGAR ( upłynnione podłoże znajduje się w łaźni pod oknem).

-2-

Badania walidacyjne mają na celu sprawdzenie czy warunki badania nie mają negatywnego wpływu na prawidłowość uzyskiwanych wyników.

Walidacja metody rozcieńczania-neutralizowania

1. Walidacja wybranych warunków badania (wartość A)

• Umieścić w probówce 1 ml płynu rozcieńczającego Trypton-NaCl oraz 1 ml zawiesiny drobnoustroju testowego zawierającej

od 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/ml,

• Zawartość probówki zamieszać, dodać 8,0 ml twardej wody i znowu zamieszać,

• Przed upływem 5 min pobrać dwie próbki po 1.0 ml mieszaniny i przenieść do dwóch płytek Petriego.

• Dodać upłynnionego podłoża TSA - AGAR inkubować w 36-37^o C,

2. walidacja toksyczności neutralizatora (wartość B) sprawdzenie, czy sam neutralizator nie ma negatywnego wpływu na przeżywalność drobnoustrojów testowych

• Umieścić w probówce 8.0 ml neutralizatora i 1.0 ml wody twardej,

• Dodać 1.0 ml zawiesiny szczepu testowego zawierającej

od 6x10² do 3x10³ cfu/m zamieszać, pozostawić przez 5 min,

• Zawartość probówki zamieszać, pobrać próbki po 1.0 ml do dwóch płytek Petriego.

• Dodać upłynnionego podłoża TSA-AGAR, inkubować w 36-37^o C, UWAGA!!! UPŁYNNIONE PODŁOŻE TSA - AGAR ZNAJDUJE SIĘ W ŁAŹNI WODNEJ

-3-

Walidacja metody rozcieńczania - neutralizacji (sprawdzenie skuteczności neutralizatora) - (wartość C)

• Dodać do probówki 2 ml rozcieńczalnika - trypton-NaCl,

a następnie 8.0 ml badanego produktu w najwyższym

stężeniu jakie jest badane,

• Zawartość probówki zamieszać, przenieść 1 ml do przygotowanego wcześniej 8 ml neutralizatora, pozostawić przez 5 min. (czas niezbędny dla neutralizacji),

• Dodać 1 ml. zawiesiny bakteryjnej zawierającej

od 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/ml, popatrzeć na zegarek

i pozostawić przez 30 min.

• Pobrać dwie próbki po 1.0 ml mieszaniny i przenieść do

2 płytek Petriego.

• Dodać upłynnionego podłoża TSA-AGAR, inkubować

Przy starannie wykonanych próbach

A=B=C= 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/ml

Walidacja metody sączenia przez filtr membranowe

- walidacja procedury sączenia.

• Pobrać dwie próbki po 0,1 ml zawiesiny szczepu testowego o gęstości 6x10²do 3,0x10³ cfu/ml i dodać do dwóch oddzielnych kolbek zawierających po ok. 50 ml płynu płuczącego,

• Próbki przesączyć przez filtr membranowy, przepłukać

ok. 50 ml płynu płuczącego.

• Filtry przenieść na 2 płytki z podłożem TSA-AGAR,

• Po inkubacji należy policzyć kolonie wyrosłe na filtrze.

Uwaga! Filtr należy ułożyć stroną sączoną do góry w taki sposób, aby powietrze nie dostało się między filtr a powierzchnię agaru.

-4-

Badanie metodą rozcieńczania-neutralizowania - wykonuje się oddzielnie dla wszystkich 3 stężeń preparatu STERINOL

Do trzech, odpowiednio podpisanych stężeniem preparatu, probówek należy dodawać kolejno:

- 1.0 ml rozcieńczalnika Trypton-NaCl,

- 1.0 ml zawiesiny bakterii testowych zawierającej

od 1.5x10⁸ do 5.0x10⁸ cfu/ml.,

- 8.0 ml badanego rozcieńczonego Sterinolu,

- zawartość probówek zamieszać i po upływie 1min kontaktu bakterii z preparatem,

- pobrać 1.0 ml mieszaniny i przenieść do probówki zawierającej 8.0 ml neutralizatora i 1.0 ml wody twardej, pozostawić w celu neutralizacji na 5 minut na stole laboratoryjnym,

- pobrać próbkę 1.0 ml przenieść do płytki Petriego i zalać podłożem TSA-AGAR, starannie i powoli wymieszać

Badanie metodą sączenia przez filtry membranowe preparatu STERINOL w różnych stężeniach:

Do trzech, odpowiednio podpisanych stężeniem preparatu, probówek należy dodawać kolejno:

• 1.0 ml rozcieńczalnika Trypton-NaCl,

• 1.0 ml zawiesiny bakteryjnej zawierającej

od 1.5x10⁸ do 5.0x10⁸ cfu/ml

• 8.0 ml badanego rozcieńczonego Sterinolu, zawartość

probówki natychmiast zamieszać,

• po upływie 1 min kontaktu bakterii ze środkiem

dezynfekcyjnym pobrać 0.1 ml mieszaniny do kolbki

zawierającej 50 ml płynu płuczącego (poprzez rozcieńczenie

następuje przerwanie działania Sterinolu),

• zawartość kolbki natychmiast przesączyć przez filtr

membranowy,

• filtr przepłukać co najmniej 150 ml płynu

płuczącego (nie więcej niż 500 ml), a następnie przenieść na

płytkę z agarem TSA. Inkubować w cieplarce.

-5-

2. Kontrola skuteczności procesów sterylizacji

Sporal A - biologiczny wskaźnik kontroli procesu sterylizacji parą wodną w autoklawie. Paski bibuły nasycone są zawiesiną spor Geobacillus stearothermophilus.

Próba kontrolna: zachowując warunki aseptyczne wyjąć pasek bibułowy z opakowania papierowo-foliowego i przenieść go do 10 ml bulionu TBS. Inkubować do 7 dni w temperaturze 56^o C

Próba badana: włożyć wskaźniki testowe w miejscach najtrudniej dostępnych dla czynnika sterylizującego, po czym przeprowadzić ustalony program sterylizacji. Po jego zakończeniu przenieść paski do 10 ml bulionu TBS i poddać je procesowi inkubacji; jeśli proces sterylizacji przebiegał prawidłowo bulion powinien zostać klarowny.

Sporal S - biologiczny wskaźnik kontroli procesu sterylizacji w suchym gorącym powietrzu. Krążki bibuły zawierają od 10⁶ do 10⁸ zarodników Bacillus subtilis. Sporal S ulega wyjałowieniu gdy czas sterylizacji wynosi co najmniej 70 min, a temperatura suchego powietrza nie mniej niż 160^o C

Próba kontrolna: zachowując warunki aseptyczne wyjąć krążek bibułowy i przenieść go do 10 ml bulionu zwykłego. Inkubować przez 7 dni w temperaturze 37^o C

Próba badana: włożyć wskaźniki testowe w różne miejsca komory sterylizatora, po czym przeprowadzić ustalony program sterylizacji. Po jego zakończeniu przenieść krążki do 10 ml bulionu i poddać je procesowi inkubacji; jeśli proces sterylizacji przebiegał prawidłowo bulion powinien zostać klarowny.

3. Sterylizacja roztworów witamin techniką sączenia

Na każdym stole znajduje się w probówce ok. 10ml nie jałowego podłoża z dodatkiem aminokwasu. Takie podłoże wymaga sterylizacji metodą filtracji. Dlatego też należy:

• Z probówki przed sączeniem pobrać pipetą ok. 0,2 ml podłoża i przenieść do probówki zawierającej 5 ml bulionu podpisanej próba kontrolna

• zawartość probówki przesączyć przez filtr przy pomocy strzykawki, pobrać 0,2 ml filtratu i przenieść do probówki podpisanej próba badana zawierającej 5 ml bulionu

• Interpretacja wyników:

• Jeśli podłoże zostało wysterylizowane bulion w próbówce podpisanej próba badana powinien być klarowny,

• bulion w probówce podpisanej próba kontrolna powinien być mętny.

-6-

4. Działanie bakteriobójcze promieniowania UV

Do doświadczenia używamy hodowli dwóch drobnoustrojów znajdujących się na stole laboratoryjnym podpisane nazwą gatunkową szczepu oraz skrótem UV. Następnie:

• hodowlę każdego szczepu (objętość 0.1 ml) posiać na 4 płytki podpisane UV (posiew powierzchniowy głaszczką zanurzoną uprzednio w spirytusie),

• płytki z posianymi drobnoustrojami eksponujemy na promieniowanie UV przez 1, 3, 7 i 15 minut. W trakcie naświetlania płytki przykrywamy wieczkiem do połowy (promieniowanie UV nie przenika przez szkło, zakryta część płytki posłuży jako kontrola),

• płytki inkubujemy, a następnie porównujemy wrażliwość różnych gatunków bakterii na promieniowanie UV.

5. Ćwiczenia praktyczne higienicznej dezynfekcji rąk przy użyciu lampy UV.

Dezynfekcja rąk - Dostają Państwo do dyspozycji w butelkach z dozownikami mieszaninę środka dezynfekcyjnego i związku o działaniu fluorescencyjnym. Mieszanina pod lampą daje białą fluorescencję.

Dłonie należy dezynfekować w sposób jaki pokazano na rysunkach. Proces dezynfekcji rąk jest podzielony na 6 „kroków”; każdy „krok” należy powtórzyć 5x. Następnie ręce należy obejrzeć pod lampą.

Po przeprowadzeniu prawidłowej dezynfekcji, całe dłonie powinny świecić; miejsca nie świecące pokazują gdzie preparat nie dotarł (przeważnie skórki przypaznokciowe, miejsca między palcami, prawy kciuk, nadgarstki).

Dobrym przykładem jest zdezynfekowanie rąk np. z pierścionkiem. Po jego zdjęciu i włożeniu rąk pod lampę mamy dobrze widoczne miejsca nie świecące w postaci nie świecącej obrączki na skórze.

Po całym doświadczeniu ręce należy umyć zwykłym mydłem.

-1-

ĆWICZENIE 4 czwartek/piątek

1. Dezynfekcja rąk mieszaniną środka dezynfekcyjnego i związku o działaniu fluorescencyjnym oraz kontrola dezynfekcji pod lampą

-1-

1. Kontrola skuteczności procesów sterylizacji

Sporal A - biologiczny wskaźnik kontroli procesu sterylizacji parą wodną w autoklawie. Paski bibuły nasycone są zawiesiną spor Geobacillus stearothermophilus.

Próba kontrolna: zachowując warunki aseptyczne wyjąć pasek bibułowy z opakowania papierowo-foliowego i przenieść go do 10 ml bulionu TBS. Inkubować do 7 dni w temperaturze 56^o C

Próba badana: włożyć wskaźniki testowe w miejscach najtrudniej dostępnych dla czynnika sterylizującego, po czym przeprowadzić ustalony program sterylizacji. Po jego zakończeniu przenieść paski do 10 ml bulionu TBS i poddać je procesowi inkubacji; jeśli proces sterylizacji przebiegał prawidłowo bulion powinien zostać klarowny.

Sporal S - biologiczny wskaźnik kontroli procesu sterylizacji w suchym gorącym powietrzu. Krążki bibuły zawierają od 10⁶ do 10⁸ zarodników Bacillus subtilis. Sporal S ulega wyjałowieniu gdy czas sterylizacji wynosi co najmniej 70 min, a temperatura suchego powietrza nie mniej niż 160^o C

Próba kontrolna: zachowując warunki aseptyczne wyjąć krążek bibułowy i przenieść go do 10 ml bulionu zwykłego. Inkubować przez 7 dni w temperaturze 37^o C

Próba badana: włożyć wskaźniki testowe w różne miejsca komory sterylizatora, po czym przeprowadzić ustalony program sterylizacji. Po jego zakończeniu przenieść krążki do 10 ml bulionu i poddać je procesowi inkubacji; jeśli proces sterylizacji przebiegał prawidłowo bulion powinien zostać klarowny.

2. Badanie czystości powietrza (dysponują Państwo trzema płytkami przeznaczonymi do badań powietrza w różnych częściach Zakładu, włącznie z piwnicą lub toaletą; zależy to od Was i asystenta)

3. Badanie czystości rąk ( dysponują Państwo płytkami na których można odciskać np. palce rąk)

4. Badanie czystości powierzchni ( dysponują Państwo płytkami tzw. kontaktowymi, które można delikatnie dociskać do ściany, podłogi a nawet fartuszka; sposób wykonania tego zadania zależy w dużej mierze od Państwa inwencji)

5. Kontrola procesów sterylizacji w suszarce i w autoklawie przy pomocy specjalnych taśm

6. Badanie działania bakteriobójczego promieniowania UV

Do doświadczenia używamy hodowli trzech drobnoustrojów znajdujących się na stole laboratoryjnym podpisane nazwą gatunkową szczepu oraz skrótem UV. Następnie:

1. hodowlę każdego szczepu (objętość 0.1 ml) posiać na 4 płytki podpisane UV (posiew powierzchniowy głaszczką zanurzoną uprzednio w spirytusie),

2. płytki z posianymi drobnoustrojami eksponujemy na promieniowanie UV przez 1, 10, 30 i 45 minut. W trakcie naświetlania płytki przykrywamy wieczkiem do połowy (promieniowanie UV nie przenika przez szkło, zakryta część płytki posłuży jako kontrola),

Płytki inkubujemy, a następnie porównujemy wrażliwość różnych gatunków bakterii na promieniowanie UV.

7. Sterylizacja podłóż z dodatkiem roztworów witamin lub aminokwasów techniką sączenia

Na każdym stole znajduje się 2 probówki zawierające ok. 10ml nie jałowego podłoża z dodatkiem witaminy lub aminokwasu. Takie podłoża nie mogą zostać wysterylizowane w wysokiej temperaturze, ale możemy zastosować w takiej sytuacji metodę filtracji. W tym celu należy:

• Próbkę podłoża z dodatkiem witaminy (2-ga grupa podłoże z aminokwasem) pobrać za pomocą strzykawki, a następnie przesączyć przez filtr umieszczony w specjalnym urządzeniu zwanym „bączkiem”. Podłoże powinno zostać przesączone do jałowej probówki.

• Dla sprawdzenia czy filtrat (przesącz) jest rzeczywiście jałowy, należy starannie i w warunkach aseptycznych pobrać jego próbkę (od 0,2 do 0,5)ml i umieścić ją w 5 ml bulionu odżywczego (podpis próba badana).

• Dla sprawdzenia czy podłoże było nie jałowe należy z probówki przed sączeniem pobrać pipetą ok. 0,2-0,5 ml podłoża i przenieść do probówki zawierającej 5 ml bulionu (dla rozróżnienia proponuję podpisać tę probówkę próba kontrolna). Probówki należy poddać procesowi inkubacji

• Interpretacja wyników:

• Jeśli podłoże zostało wysterylizowane bulion w próbówce podpisanej próba badana powinien być klarowny,

• bulion w probówce podpisanej próba kontrolna powinien być mętny.

Cwiczenie 5 wt/środa 28/29/04/09r

1. Określenie aktywności bakteriobójczej preparatów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania

Celem próby jest ustalenie czy produkt przeznaczony do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania zmniejsza uwalnianie przejściowej flory zgodnie z wymaganiami, wówczas gdy środek ten jest wcierany w sztucznie zanieczyszczone ręce ochotników (symulacja praktycznych warunków).

Normę tę stosuje się, gdy dezynfekcja wskazana jest ze względów medycznych.

Wymagania

Średnia wartość redukcji liczby drobnoustrojów testowych ze sztucznie skażonych dłoni nie powinna być statystycznie znacząco mniejsza niż ta uzyskiwana w wyniku wzorcowej dezynfekcji za pomocą 60% 2-propanolu.

ZASADA METODY

Liczba drobnoustrojów testowych uwalnianych z opuszek palców sztucznie zanieczyszczonych rąk jest oceniana przed i po higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania. Stosunek dwóch uzyskanych wartości jest nazywany współczynnikiem redukcji.

Wykonanie badania.

1. Umyć ręce łagodnym mydłem w celu usunięcia naturalnej flory przejściowej, wysuszyć ręce za pomocą ręczników papierowych. Zanurzyć na 5 sekund obie ręce do połowy śródręcza (palce rozstawione) w 18-24 godz. hodowli bulionowej Escherichia coli ATCC 10538. Trzymać ręce w pozycji poziomej przez 3 min, powoli obracać nimi aż do obeschnięcia.

Szczep jest absolutnie bezpieczny, przeznaczony specjalnie do badań dezynfekcji rąk.

2. Pocierać przez 1 min opuszkami palców o dno płytek Petriego zawierających po10 ml bulionu TSB bez neutralizatora (bulion należy wlać do płytek samemu;do każdej ręki stosować oddzielną płytkę).

3. Z bulionów TSB przygotować w soli fizjologicznej rozcieńczenia do10⁴

Wysiewać próbki bulionu rozcieńczonego 10^-2 oraz rozcieńczonego 10^-4

(0.1ml na powierzchnię płytki z podłożem TSA- Agar, rozprowadzić głaszczką wypaloną w spirytusie po powierzchni płytki), inkubować.

W ten sposób ocenia się wartość początkową czyli uwalnianie drobnoustrojów testowych przed zastosowaniem procedury dezynfekcji.

Uwaga! Dezynfekcję rąk produktem wzorcowym lub badanym wykonują osoby po skażeniu rąk szczepem testowym

4. Dezynfekcja rąk wzorcowym produktem: nalać 3 ml 60% 2-propanolu na suche dłonie ułożone w kształt kubka i wcierać mocno w skórę przez 30 sek. Procedura obejmuje na każdym etapie pięciokrotne pocieranie dłoni (patrz rysunek). Procedurę należy powtórzyć z następnymi 3ml propanolu tak, aby całkowity czas wcierania wynosił 60 sek, a następnie przez 5 s należy płukać palce w bieżącej wodzie wodociągowej.

-2-

5. Dezynfekcja rąk badanym produktem: procedura powinna być realizowana zgodnie z informacją dostarczoną przez wytwórcę. Całkowity czas wcierania powinien być ograniczony do 30s lub 60s. Procedura kończy się 5sek płukaniem palców w bieżącej wodzie i strząśnięcie jej nadmiaru.

6. Pocierać przez 1 min opuszkami zdezynfekowanych palców o dno płytek Petriego zawierających 10 ml bulionu TSB z dodatkiem neutralizatora (do każdej ręki stosować oddzielną płytkę; bulion trzeba wlać do płytek samemu).

7. Na płytki z TSA z inaktywatorem posiać 0.1 ml bulionu nie rozcieńczonego, rozetrzeć głaszczką, inkubować.

W ten sposób ocenia się wartość końcową w próbie czyli uwalnienie drobnoustrojów testowych po zastosowaniu procedury dezynfekcji (preparatem badanym lub wzorcowym).

8. Następnie należy określić liczbę bakterii przed i po procesie dezynfekcji, Uwaga. Badanie wg normy powinno być prowadzone z udziałem 12-15 osób, których skóra jest zdrowa, bez skaleczeń lub otarć. W doświadczeniach nie powinno się korzystać z oferty osób posiadających zgrubiałą i zniszczoną skórę.

2. Oznaczanie poziomu penicyliny G w surowicy krwi przy użyciu techniki seryjnych rozcieńczeń /MIC/.

Na stołach znajdują się:

• probówka z penicyliną o stężeniu 1j/ml,

• 2 probówki zawierające surowice o nieznanej zawartości penicyliny podpisane - surowica badana 1, surowica badana 2

• 18-godz. hodowla szczepu testowego S.aureus ATCC 6538.

Wykonanie oznaczenia:

1. Do 3 rzędów wstawić po 6 probówek, rozlać po 1 ml bulionu

2. Do pierwszej probówki pierwszego rzędu dodać 1ml wzorcowego roztworu

penicyliny (1 jednostka/ml), wymieszać, przenieść 1ml do następnej probówki.

W ten sposób wykonać seryjne rozcieńczenia od 1/2 do 1/64.

3. Do pierwszej probówki drugiego i trzeciego rzędu dodać po 1ml badanej surowicy, następnie wykonać seryjne dwukrotne rozcieńczenia ( jak wyżej)

4. Do wszystkich probówek dodać po 1 kropli 18-godzinnej hodowli S.aureus ATCC 6538 rozcieńczonej 100x w soli fizjologicznej

5. Inkubację probówek prowadzić przez 18 godz. w temperaturze 37^oC.

-3-

3. Wykonanie oznaczenia aktywności kolistyny - metoda dyfuzyjna z

zastosowaniem krzywej wzorcowej. Na stole laboratoryjnym znajdują się:

• szczep testowy Bordetella bronchiseptica,

• przyrząd do robienia dziurek w agarze,

• 2 duże, puste, wysterylizowane płytki,

• roztwory kolistyny o znanych stężeniach,

• roztwory kolistyny o nieznanym stężeniu podpisane Kol A i Kol B,

Szczepem testowym używanym w oznaczeniu kolistyny jest Bordetella bronchiseptica ATCC 4617. Oznaczenie to można wykonywać metodą z użyciem stalowych cylinderków lub z wykorzystaniem otworów o średnicy 10 mm wycinanych w agarze.

Dla wyznaczenia krzywej wzorcowej przygotowuje się w buforze fosforanowym o pH 6,0 sześć roztworów wzorca o następujących stężeniach:

10.0; 9.0; 7.0; 5,0, 3,0, 1,0 ၭg/cm³. Próbki wzorca oraz próbki badane Kol A i Kol B są już przygotowane i znajdują się w probówkach typu Ependorf.

Należy :

1. Przygotować 2 płytki z podłożem zakażonym bakteriami testowymi- (szczep znajduje się na każdym stole laboratoryjnym).

Wykonujemy to w następujący sposób:

a/ Podłoże AM10 w ilości wystarczającej na dwie duże płytki znajduje się w łaźni wodnej; należy je wystudzić (nie pod zimną wodą- bo się robią skrzepy) i bardzo delikatnie( aby nie powstały pęcherzyki powietrza) wymieszać z 2 ml szczepu wzorcowego Bordetella bronchiseptica

b/ Płytki należy wylać na wypoziomowanym stole w pokoju obok sali ćwiczeń i nie opalać jej powierzchni nawet gdy utworzą się pęcherzyki powietrza (aby nie zabić drobnoustroju testowego),

c/ Po zastygnięciu podłoża płytki należy przenieść na ok. 30 min. do lodówki a następnie wyborować 7 dziurek zanurzoną w alkoholu i opaloną w płomieniu palnika opiłowaną pipetą - agar z wnętrza dziurek wyjmujemy do płytki Petriego za pomocą wykonanego z ezy haka - (płytka na odpady z materiałem zakaźnym znajduje się na każdym stole),

2. Do dziurek wkroplić po 100ၭl = 0.1 ml roztworów prób wzorcowych (standard kolistyny) oraz próby badane

3. Płytki pozostawić w temperaturze pokojowej na 0,5 godziny, a potem inkubować w temperaturze 35⁰C przez 16-18 godz.

4. Po zakończeniu inkubacji, zmierzyć strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego wokół otworów i wykreślić krzywą wzorcową, z której następnie odczytuje się zawartość kolistyny w próbach badanych.

UWAGA. Grupa asystencka wykonuje to doświadczenie w dwóch powtórzeniach. W każdej płytce robi się 7 dziurek; do 6 wkrapla się kolistynę w znanych stężeniach do siódmej próbki badane podpisane Kol A - 1 płytka lub Kol B - druga płytka.

-4-

3. Badanie skuteczności ochrony przeciwdrobnoustrojowej leku -

wysiew mieszaniny syropu i drobnoustroju testowego w

rozcieńczeniu N i 10^-1

Ćwiczenie 3 - Odczyt wyników z poprzedniego ćwiczenia:

1. Ocena aktywności bakteriobójczej preparatów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk; policzyć kolonie wyrosłe na płytkach, aby oznaczyć:

a/ wartość początkową czyli uwalnianie drobnoustrojów testowych przed zastosowaniem procedury dezynfekcji.

b/ liczbę uwalnianych drobnoustrojów testowych po zastosowaniu procedury dezynfekcji wzorcowym środkiem dezynfekcyjnym,

c/ liczbę uwalnianych drobnoustrojów testowych po zastosowaniu procedury dezynfekcji badanym środkiem dezynfekcyjnym

d/ zapisać i porównać wyniki, obliczyć współczynnik redukcji.

2. Badanie preparatu dezynfekcyjnego STERINOL dwoma metodami: rozcieńczania - neutralizacji i sączenia przez filtry membranowe.

a/ policzyć kolonie na płytkach, zapisać wyniki a następnie obliczyć stopień redukcji bakterii testowych i ocenić czy preparat spełnia zalecenia normy.

3. Oznaczanie poziomu penicyliny w surowicy krwi

techniką seryjnych rozcieńczeń,

ODCZYT: Ustalić, w jakich rozcieńczeniach wzorcowa i badana próbka surowicy hamują wzrost testowego szczepu S.aureus

Obliczyć stężenie penicyliny w badanej surowicy na podstawie wzoru:

A

D = --- Ⴔ C gdzie:

B

D - stężenie penicyliny w surowicy krwi badanej,

A - odwrotność rozcieńczenia surowicy badanej hamującego

wzrost gronkowca,

B - odwrotność rozcieńczenia surowicy wzorcowej hamującego

wzrost gronkowca,

C - stężenie penicyliny w surowicy wzorcowej (1 j/ml)

Przykład: rozcieńczenie surowicy badanej hamujące wzrost gronkowca wynosi 1/64, rozcieńczenie surowicy wzorcowej 1/32, stężenie penicyliny w surowicy badanej 1j /ml:

64

D = ----- Ⴔ 1 = 2 j /ml

32

Oznaczenia aktywności kolistyny metodą dyfuzyjną z zastosowaniem krzywej wzorcowej.

Odczyt: po zakończeniu inkubacji, zmierzyć przy użyciu papieru milimetrowego strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego wokół otworów i wykreślić krzywą wzorcową, (na papierze milimetrowym) Z krzywej wzorcowej odczytuje się zawartość kolistyny w próbach badanych.

4. SYROP pamiętajcie!!!

Instrukcja dla grupy pracującej z

Pseudomonas aeruginosa

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.7

Rozcieńczenia STERINOLU: 75x; 150x i 300x

Instrukcja dla grupy pracującej z

Escherichia coli

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.7

Rozcieńczenia STERINOLU: 75x; 150x i 300x

Instrukcja dla grupy pracującej z

Staphylococcus aureus

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.8

Rozcieńczenia STERINOLU: 250x; 500x; 750x

Instrukcja dla grupy pracującej z

Enterococcus hirae

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.8

Rozcieńczenia STERINOLU: 250x; 500x; 750x

---